一種cik細胞培養液及cik細胞的培養方法和香菇多糖在cik細胞培養中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種CIK細胞培養液及CIK細胞的培養方法 和香菇多糖在CIK細胞培養中的應用。
【背景技術】
[0002] 自體免疫細胞治療是最成熟的腫瘤生物治療技術，它是從患者自體外周血中分離 出單個核細胞，經過體外實驗室激活、修飾、擴增后回輸到患者體內，起到調節和增強患者 的免疫功能，并直接殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞的作用。從上世紀80年代應用于臨床腫 瘤治療以來，自體免疫細胞治療技術日趨成熟，越來越得到腫瘤患者與醫生的認可。
[0003] 自體免疫細胞治療按照方式不同，主要可分為主動免疫治療和過繼性免疫治療兩 種。其中，主動免疫治療是采集患者的外周血，分離能夠活化患者自身體內抗腫瘤細胞的因 子，然后在體外培養、修飾、增殖后回輸到患者體內，這樣就能迅速激發增強人體自身的抗 癌能力；過繼性免疫治療是分離患者自身體內本就存在的抗癌細胞，在體外活化，增殖后直 接輸入患者體內對抗腫瘤。
[0004] 細胞因子誘導的殺傷（Cytokine-InducedKiller,CIK)細胞是一種用于過繼性免 疫治療的抗癌細胞。CIK細胞由于同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK 細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點。 因此，應用CIK細胞被認為是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。
[0005] 目前，常見的CIK細胞體外培養方法是在添加相應的細胞因子的無血清培養基中 培養外周血單個核細胞（PBMC)，在細胞因子的刺激下誘導PBMC成為CIK細胞。但采用這種 方法培養CIK細胞時，CIK細胞的增殖效果較差。
【發明內容】
[0006] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種CIK細胞培養液及CIK細胞的培養方法和 香菇多糖在CIK細胞培養中的應用，CIK細胞在本發明提供的培養液中的增殖效果較好。
[0007] 本發明提供了一種CIK細胞培養液，包括干擾素-y、⑶3激發型單抗、白細胞介 素-2、香菇多糖和無血清基礎培養基。
[0008] 優選的，所述香菇多糖在培養液中的含量為0. 05~0. 3mg/mL。
[0009] 優選的，所述培養液還包括血清。
[0010] 優選的，所述血清在培養液中的體積百分含量為5~20%。
[0011] 優選的，所述干擾素-y在培養液中的含量為200~lOOOU/mL;所述⑶3激發型 單抗在培養液中的含量為10~80ng/mL;所述白細胞介素-2在培養液中的含量為100~ 600U/mL〇
[0012] 本發明提供了一種CIK細胞的培養方法，包括以下步驟：
[0013] a)、使用權利要求1~5任意一項所述的培養液培養外周血單個核細胞，獲得CIK 細胞。
[0014] 優選的，所述步驟a)具體包括以下步驟：
[0015] al)、外周血單個核細胞在所述培養液中重懸，得到細胞懸液；
[0016] a2)、將所述細胞懸液接種到細胞培養容器中進行培養，獲得CIK細胞。
[0017] 優選的，所述細胞懸液中的外周血單個核細胞密度為0. 5XIO6~IX10 6個/mL。
[0018] 優選的，所述培養的溫度為37°C;所述培養的CO2體積濃度為5% ;所述培養的時 間為12~16天。
[0019] 本發明提供了一種香菇多糖在CIK細胞培養中的應用。
[0020] 與現有技術相比，本發明提供了一種CIK細胞培養液及CIK細胞的培養方法和香 菇多糖在CIK細胞培養中的應用。本發明提供的CIK細胞培養液包括干擾素-Y、CD3激發 型單抗、白細胞介素-2、香菇多糖和無血清基礎培養基。本發明在CIK細胞培養液中加入香 菇多糖，使用這種培養液進行CIK細胞培養時，能夠促進PBMC產生淋巴細胞活化因子和釋 放輔助性T細胞因子，從而促進CIK細胞的增殖，進而使培養得到的CIK細胞表現出大的擴 增倍數、強的殺傷活性和高的細胞表面抗原含量。實驗結果表明，采用本發明提供的培養液 培養CIK細胞14天后，CIK細胞擴增倍數大于300倍，CIK細胞體外殺傷率（效靶比40:1) 大于（80±2) %，CIK細胞表面抗原（CD3+和CD56+)數量大于48%。
【具體實施方式】
[0021] 下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例 僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范 圍。
[0022] 本發明提供了一種CIK細胞培養液，包括干擾素-y、⑶3激發型單抗、白細胞介 素-2、香菇多糖和無血清基礎培養基。
[0023] 在本發明中，所述干擾素-Y(IFN-Y)是一種水溶性二聚體細胞因子，具有抗病 毒、免疫調節及抗腫瘤特性。在本發明提供的一個實施例中，所述干擾素-Y在CIK細胞培 養液的含量為200~lOOOU/mL;在本發明提供的另一個實施例中，所述干擾素-y在CIK細 胞培養液的含量為400~800U/mL;本發明對所述干擾素-y的來源沒有特別限定，采用市 售商品即可。在本發明中，所述干擾素-T的主要作用是通過與培養液中的其他組分協同 作用，從而促進CIK細胞的增殖，增強CIK細胞殺傷腫瘤的活性。
[0024] 在本發明中，所述⑶3激發型單抗又稱⑶3單抗，可與T淋巴細胞表面的⑶3分子 進行特異性結合。在本發明提供的一個實施例中，所述CD3激發型單抗在培養液中的含量 為10~80ng/mL;在本發明提供的另一個實施例中，所述CD3激發型單抗在培養液中的含 量為20~60ng/mL。本發明對所述CD3激發型單抗的來源沒有特別限定，采用市售商品即 可。在本發明中，所述CD3激發型單抗的主要作用是通過與培養液中的其他組分協同作用， 從而促進CIK細胞的增殖，增強CIK細胞殺傷腫瘤的活性。
[0025] 在本發明中，所述白細胞介素-2(IL-2)是由多種細胞產生并作用于多種細胞的 一類細胞因子，由于最初是由白細胞產生又在白細胞間發揮作用，所以由此得名。在本發 明提供的一個實施例中，所述白細胞介素-2在培養液中的含量為100~600U/mL;在本發 明提供的另一個實施例中，所述白細胞介素-2在培養液中的含量為200~500U/mL。本發 明對所述白細胞介素-2的來源沒有特別限定，采用市售商品即可。在本發明中，所述白細 胞介素-2的主要作用是通過與培養液中的其他組分協同作用，從而促進CIK細胞的增殖， 增強CIK細胞殺傷腫瘤的活性。
[0026] 在本發明中，所述香菇多糖是從香菇子實體中提取的有效活性成分，香菇多糖中 的活性成分是具有分支的(6-(1-3)-D-葡聚糖，其主鏈由(6-(1-3)-連接的葡萄糖基組成， 沿主鏈隨機分布著由(6-(1-6)連接的葡萄糖基，呈梳狀結構。在本發明提供的一個實施 例中，所述香菇多糖在培養液中的含量為〇. 05~0. 3mg/mL;在本發明提供的另一個實施例 中，所述香菇多糖在培養液中的含量為〇. 0625~0. 25mg/mL。本發明對所述香菇多糖的來 源沒有特別限定，采用市售商品即可。在本發明中，所述香菇多糖的主要作用是促進CIK細 胞的增殖，增強CIK細胞殺傷腫瘤的活性。
[0027] 在本發明中，所述無血清基礎培養基是CIK細胞培養液的基礎成分。在本發 明提供的一個實施例中，所選用的無血清基礎培養基為RPMI(RoswellParkMemorial Institute)提供的RPMI-1640培養基。在本發明中，所述無血清基礎培養基的作用是在細 胞培養過程中為培養的細胞提供必需的營養成分。
[0028] 在本發明提供的一個實施例中，所述CIK細胞培養液還包括血清。在本發明提供 的一個實施例中，所述血清為自體血清。在本發明提供的一個實施例中，所述血清在培養液 中的體積百分含量為5~20% ;在本發明提供的另一個實施例中，所述血清在培養液中的 體積百分含量為5~10%。在本發明中，所述血清的主要作用是在細胞培養過程中為細胞 生長和增殖提供營養，同時通過與培養液中的其他組分協同作用促進CIK細胞的增殖，增 強CIK細胞殺傷腫瘤的活性。
[0029] 本發明在CIK細胞培養液中加入香菇多糖，使用這種培養液進行CIK細胞培養時， 能夠促進PBMC產生淋巴細胞活化因子和釋放輔助性T細胞因子，從而促進CIK細胞的增 殖，進而使培養得到的CIK細胞表現出大的擴增倍數、強的殺傷活性和高的細胞表面抗原 含量。同時，本發明通過優化CIK細胞培養液的配方，通過培養液中各組分的協同作用，進 一步促進CIK細胞的增殖，增強CIK細胞殺傷腫瘤的活性。實驗結果表明，采用本發明提供 的培養液培養CIK細胞14天后，CIK細胞擴增倍數大于300倍，CIK細胞體外殺傷率（效靶 比40:1)大于（80±2)%，CIK細胞表面抗原（⑶3+和⑶56+)數量大于48%。
[0030] 本發明提供了一種CIK細胞的培養方法，包括以下步驟：
[0031] a)、使用上述技術方案所述的培養液培養外周血單個核細胞，獲得CIK細胞。
[0032] 在本發明提供的培養方法中，通過使用所述培養液培養外周血單個核細胞，獲得 CIK細胞，該過程具體包括以下步驟：
[0033] al)、外周血單個核細胞在所述培養液中重懸，得