一種重組慢病毒及其在制備治療可卡因成癮的藥物中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重組慢病毒及其在制備治療可卡因成癮的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 可卡因（Cocaine)又稱古柯堿，化學名為苯甲酰甲基芽子堿（methyl benzoylecgonine)，一般呈白色晶體狀，無臭，味苦而麻，其最早用于局部麻醉和治療哮 喘，是最強的天然中樞興奮劑，因其對中樞神經系統的興奮作用而導致濫用，1985年起成為 世界性主要毒品之一。
[0003] 可卡因成癮，是一種慢性復發性腦部疾病，屬于藥物依賴（drugdependence)類疾 病，可卡因成癮會引起大腦結構和功能的可塑性變化，相關腦區包括伏隔核、紋狀體、前額 皮質、海馬和腹側被蓋區，健康也受到多方面的危害，包括精神頹廢、人格缺損、心智功能紊 亂、并發相應的感染合并癥以及吸毒者不顧一切地尋求和使用毒品而誘發各種違法犯罪活 動。
[0004] 可卡因成癮的主要特點表現為即使患者在知曉用藥的嚴重后果后，依然強迫性索 取和使用以滿足欲望、對藥物的尋覓和索取失去控制、對事物失去興趣、成癮記憶十分深 亥IJ，即使經過戒斷治療若干年后，接觸與成癮有關的刺激（如毒友、與過去用藥有關的環境 等）都可能誘發復吸。
[0005] 鑒于可卡因成癮危害甚大，找到合適的治療靶點和藥物，治療可卡因成癮迫在眉 睫。
【發明內容】
[0006] 為了解決上述問題，本發明提供了一類治療可卡因成癮的藥物。
[0007]HMGCS2 :3羥3甲戊二酰輔酶A合成酶2。
[0008]HMGCS2抑制劑：抑制3羥3甲戊二酰輔酶A合成酶的活性或者表達的物質。
[0009] 首先，本發明提供了一種核苷酸序列，其核苷酸序列如下（SEQIDNO. 1所示。
[0010] 本發明還提供了一種核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0011] 本發明還提供了一種重組質粒，它包括SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所述核苷酸 序列的重組質粒。
[0012] 優選地，所述重組質粒是重組PLLU2G質粒。進一步優選地，所述重組質粒的核苷 酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0013] 本發明還提供了一種重組慢病毒，它包含前述任意一項的重組質粒。
[0014] 本發明還提供了前述的核苷酸序列、重組質粒或重組慢病毒在制備HMGCS2抑制 劑中的用途。
[0015] 本發明還提供了前述的核苷酸序列、重組質粒或重組慢病毒在制備可卡因成癮的 藥物中的用途。
[0016] 本發明還提供了一種治療可卡因成癮的藥物，它是以前述的核苷酸序列、重組質 粒或重組慢病毒為活性成分，加上藥學上可接受的輔料制備而成的制劑。
[0017] 優選地，所述制劑是注射制劑。
[0018] 本發明SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示shRNA引物、包含前述shRNA引物的重 組質粒以及包含該重組質粒的重組慢病毒，可以沉默HMGCS2基因，下調HMGCS2的表達，有 效減弱可卡因獎賞行為，減輕行為敏化和條件性位置偏好程度，治療可卡因成癮，臨床應用 前景良好。
[0019] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明權利要 求書記載的內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0020] 圖1小鼠條件性位置偏好箱
[0021] 圖2條件性位置偏好實驗設計示意圖。GroupI:生理鹽水組；GroupII:可卡因 組。S:腹腔注射生理鹽水；C:腹腔注射可卡因。
[0022] 圖3小鼠自發活動箱
[0023] 圖4可卡因處理誘導小鼠伏隔核HMGCS2的表達及活性。（A)可卡因條件性位置 偏好小鼠伏隔核HMGCS2的表達水平。⑶可卡因單次給藥后30min(Single-30min)和 24h(Single_24h)，連續給藥7天〇tepeated-7days)后伏隔核HMGCS2的表達水平。（C) 可卡因條件性位置偏好小鼠伏隔核HMGCS2的酶活性。Saline，SA:腹腔注射生理鹽水組； Cocaine，CO:腹腔注射可卡因組。n= 6/組。*p〈0. 05,可卡因條件性位置偏好成癮、單次 給藥后30min和24h、連續給藥7天，各組與生理鹽水組比較有統計學差異。
[0024] 圖5伏隔核注射HMGCS2小分子抑制劑對可卡因誘導的行為敏化的影響。（A) 伏隔核注射Hymeglusin干擾可卡因自發活動行為敏化模型建立模式圖。（B)伏隔核注 射Hymeglusin對可卡因誘導的自發活動的影響，n= 15/組。（C)Hymeglusin預處理 對可卡因行為敏化小鼠伏隔核HMGCS2的酶活性的影響，n= 6/組。Saline-Saline: 伏隔核注射生理鹽水-腹腔注射生理鹽水組；Hymeglusin-Saline:伏隔核注射 Hymeglusin-腹腔注射生理鹽水組；Saline-Cocaine:伏隔核注射生理鹽水-腹腔 注射可卡因組；Hymeglusin-Cocaine:伏隔核注射Hymeglusin-腹腔注射可卡因組。 *p〈0. 05，Hymeglusin-Saline組、Saline-Cocaine組、伏Hymeglusin-Cocaine組分別與 Saline-Saline組比較有統計學差異。#p〈0. 05，Hymeglusin_Cocaine組與Saline-Cocaine 組比較有統計學差異。
[0025] 圖6伏隔核注射HMGCS2小分子抑制劑對可卡因條件性位置偏好的影響。（A) 伏隔核注射Hymeglusin干擾可卡因條件性位置偏好模型建立模式圖。（B)伏隔核注射 Hymeglusin對可卡因條件性位置偏好的影響，n= 15/組。（C)Hymeglusin預處理對可卡 因條件性位置偏好小鼠伏隔核HMGCS2的mRNA轉錄的影響，n= 15/組。（D)Hymeglusin 預處理對可卡因條件性位置偏好小鼠伏隔核HMGCS2的蛋白表達的影響，n= 15/組。 Saline-Saline:伏隔核注射生理鹽水-腹腔注射生理鹽水組；Hymeglusin-Saline:伏隔核 注射Hymeglusin-腹腔注射生理鹽水組；Saline-Cocaine:伏隔核注射生理鹽水-腹腔注 射可卡因組；Hymeglusin-Cocaine:伏隔核注射Hymeglusin-腹腔注射可卡因組。*p〈0. 05，Hymeglusin-Saline組、Saline-Cocaine組、Hymeglusin-Cocaine組分別與Saline-Saline 組比較有統計學差異。#p〈〇.〇5，Hymeglusin_Cocaine組與Saline-Cocaine組比較有統計 學差異。
[0026] 圖7HMGCS2小分子抑制劑對可卡因條件性位置偏好小鼠伏隔核能量形式的 影響。（A)Hymeglusin干擾可卡因條件性位置偏好模型下伏隔核ATP的含量變化。（B) Hymeglusin干擾可卡因條件性位置偏好模型下伏隔核乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)的含量 變化。（C)Hymeglusin干擾可卡因條件性位置偏好模型下伏隔核檸檬酸合酶活性的變 化。（D)Hymeglusin干擾可卡因條件性位置偏好模型下伏隔核NAD+/NADH比率的變化。 Saline-Saline:伏隔核注射生理鹽水-腹腔注射生理鹽水組；Hymeglusin-Saline:伏隔核 注射Hymeglusin-腹腔注射生理鹽水組；Saline-Cocaine:伏隔核注射生理鹽水-腹腔注 射可卡因組；Hymeglusin-Cocaine:伏隔核注射Hymeglusin-腹腔注射可卡因組。n= 6/ 組。*p〈0. 05,Hymeglusin-Saline組、Saline-Cocaine組、Hymeglusin-Cocaine組分別與 Saline-Saline組比較有統計學差異。#p〈0. 05，Hymeglusin_Cocaine組與Saline-Cocaine 組比較有統計學差異。
[0027] 圖8沉默伏隔核Hmgcs2對可卡因行為敏化的影響。（A)慢病毒shHmgcs2在伏 隔核注射示意圖。（B)伏隔核注射shHmgCS2慢病毒對可卡因誘導的自發活動的影響，n= 15/組。（C)可卡因行為敏化模型下，伏隔核注射shHmgcs2慢病毒對HMGCS2mRNA轉錄水 平的影響，n= 6/組。（D)可卡因行為敏化模型下，伏隔核注射shHmgCS2慢病毒對HMGCS2 蛋白表達水平的影響，n= 6/組。*p〈0.05，shHmgcs2_Saline組、shControl-Cocaine 組、shHmgcs2_Cocaine組分別與shControl-Saline組比較有統計學差異。#p〈0. 05， shHmgcs2_Cocaine組與shControl-Cocaine組比較有統計學差異。
[0028] 圖9沉默伏隔核HmgCS2基因對可卡因條件性位置偏好的影響。（A)伏隔核 注射shHmgcs2慢病毒對可卡因誘導的條件性位置偏好的影響，n= 15/組。（B)可 卡因行為敏化模型下，伏隔核注射shHmgCS2慢病毒對HMGCS2酶活性的影響，n= 6/ 組。*p〈0. 05，shHmgcs2_Saline組、shControl-Cocaine組、shHmgcs2_Cocaine組 分別與shControl-Saline組比較有統計學差異。#p〈0. 05，shHmgcs2_Cocaine組與 shControI-Cocaine組比較有統計學差異。
[0029] 圖10沉默伏隔核HmgCs2基因對可卡因條件性位置偏好小鼠伏隔核能量形式的影 響。（A)伏隔核注射shHmgcs2慢病毒干擾可卡因條件性位置偏好模型下伏隔核ATP的含量 變化。（B)伏隔核注射shHmgCS2慢病毒干擾可卡因條件性位置偏好模型下伏隔核乙酰輔酶 A(Acetyl-CoA)的含量變化。（C)伏隔核注射shHmgCS2慢病毒干擾可卡因條件性位置偏好 模型下伏隔核檸檬酸合酶活性的變化。（D)伏隔核注射shHmgCS2慢病毒干擾可卡因條件 性位置偏好模型下伏隔核NAD+/NADH比率的變化。n= 6/組。*p〈0. 05,shHmgcs2-Saline 組、shControl-Cocaine組、shHmgcs2_Cocaine組分別與shControl-Saline組比較有統計 學差異。#P〈〇. 05,shHmgcs2_Cocaine組與shControl-Cocaine組比較有統計學差異。
[0030] 圖11泳道1:空白對照；泳道2:陽性對照；泳道3~泳道9:PLLU2G-shHmgcs2①~ ⑧號克隆；M:IOObpDNA Ladder。
[0031] 圖12重組載體結構示意圖。
[0032] 圖13PLLU2G-shHmgcs2-l質粒轉染293T細胞48h病變情況。
[0033] 圖14PLLU2G-shcontrol質粒轉染293T細胞48h病變情況。
【具體實施方式】
[0034] 實施例1本發明shRNA-Hmgcs2慢病毒（干擾HMGCS2表達慢病毒）的構建
[0035]I、重組載體的制備
[0036] 一、載體信息：
[0037]質粒名稱：PLLU2G-ShHmgcs2
[0038]基因名稱：Hmgcs2
[0039]基因種屬：Musmusculus
[0040]基因長度：1527bp
[0041]克隆載體：PLLU2G
[0042] 載體抗性：Amp
[0043] 基本方案：退火、酶切連接
[0044] 二、材料與方法
[0045](一）材料
[0046] 1?儀器設備
[0047] 1)PCR儀，美國BI0-RAD，型號PTC-220/ALS-1296G/ALD1244G;
[0048] 2)電泳儀，北京市六一儀器廠，型