一種釀酒酵母染色體及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程、代謝工程及合成生物學領域，具體涉及一種釀酒酵母染色 體及其構建方法與應用；尤其涉及一種可實現多基因、多代謝通路、可擴展并無需篩選，且 穩定存在的釀酒酵母染色體及其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002] 隨著現代生物技術和生物醫藥的發展，利用外源系統表達及獲取高附加值產物的 應用越來越普遍。著名的成功案例包括青蒿素的發酵生產等。傳統的表達系統是利用微生 物如大腸桿菌、枯草桿菌和釀酒酵母等底盤生物，通過放入這些系統中原本不存在的酶基 因，從而利用這些系統中原本已經存在的代謝產物，獲取所需的目標產物。通過進一步的優 化，最終獲得較高產量和質量的產品。為了實現外源基因在這些體系中的表達，通常需要將 多個基因從其他生物中PCR擴增出來，然后放入宿主細胞內進行表達。常見的將多個外源 基因放入宿主系統的方法有：1)將多個基因分別克隆在單獨的載體上，然后將各帶有外源 基因的載體轉化進入同一個細胞；2)將多個基因分步克隆到同一個載體上，然后轉化進入 細胞；3)將多個基因分別轉化，整合到宿主基因組中。
[0003] 早期的代謝工程方法是將所需要表達的基因，利用分子生物學的方法，從該基因 的源物種中擴增，并克隆在載體上。如果同時需要表達多個基因，可以采用相同的策略，將 各個基因分別克隆到帶有不同抗性標記的載體上，每個基因都通過相同或者不同的啟動子 等生物元件進行調控。然后將構建好的質粒分步、或者共同轉化到宿主細胞（通常是大腸 桿菌）內，通過對抗性標記的篩選，獲得帶有這幾個外源基因的菌株。
[0004] 因為可供選擇的抗性基因數目有限，所以采用上述方法進行外源基因的表達受到 局限。為此，人們又開發了新的方法，即將多個基因，分步克隆到同一個載體上。這樣只需 要一種抗性載體，就可以同時轉入多個基因。利用該方法，人們可以同時表達較大數量的外 源基因。
[0005] 將多個基因克隆在同一個載體上解決了部分因為基因數目的限制，但和單獨的載 體表達一樣，對最后獲得菌株必須保持抗性的篩選。一旦篩選壓力消失，菌株所攜帶的外源 基因會很快的被丟失掉。而抗生素等的使用，也對極大的提高了工業生產成本。為了獲得 穩定的表達體系，剔除對抗生素等篩選壓力的需求，一個解決辦法是將這些外源基因整合 到宿主基因組上。但整合到染色體上的一個局限就是能夠整合的基因拷貝數低，能夠整合 的基因數目小，因此產品表達量少，很難滿足工業大量生產的目的。
[0006]因為大腸桿菌等細菌生長速度快，基因組相對簡單，分子操作技術成熟，所以它們 很早就被用于各種代謝工程的宿主。與此同時，釀酒酵母作為一種簡單的真核微生物，因為 其遺傳背景清楚，遺傳操作方便，被廣泛的用作為真核表達系統。此外，酵母被認為是一種 安全的微生物，比大腸桿菌等更有利對食品相關等產品的生產。另外，酵母具有一個強大的 同源重組系統，可以利用僅僅幾十個堿基對的同源序列，進行準確和高效的同源重組，從而 可以更為快捷的進行多基因、大片段DNA的組裝。
[0007] 因此，為了提高外源基因在酵母中的表達量、穩定性，可以將它們整合到基因組 中，而且必須保證這些基因可以在必要的情況下能夠提高拷貝數，并且實現對整合進入基 因組的基因進行增加、篩減乃至擴展新的多基因簇。與此同時，必須保證營養缺陷型標記的 最少量使用，并且可以在不進行篩選的情況下進行正常和穩定的生長。
【發明內容】
[0008] 本發明的一個目的是提供一種釀酒酵母人工染色體。
[0009] 本發明提供的釀酒酵母人工染色體包括n個重復重組盒、2個端粒重復序列、2個 隔離子序列、著絲粒-自主復制序列和P〇130基因；
[0010] 每個所述重復重組盒由上游重組目標序列、報告基因、篩選標記基因和下游重組 目標序列組成；所述報告基因和所述篩選標記基因均位于所述上游重組目標序列和所述下 游重組目標序列之間；所述n為大于等于1的自然數。
[0011] 所述上游重組目標序列和所述下游重組目標序列是與釀酒酵母人工染色體上其 余部分均不發生同源重組的序列。
[0012] 上述釀酒酵母人工染色體中，
[0013] 所述n為1或2;
[0014] 所述釀酒酵母人工染色體從上游至下游依次包括一個端粒重復序列、一個隔離子 序列、第一個重復重組盒、著絲粒-自主復制序列、P〇130基因、第二個重復重組盒、另一個 隔離子序列和另一個端粒重復序列；
[0015] 或所述釀酒酵母人工染色體從上游至下游依次包括一個端粒重復序列、一個隔離 子序列、第一個重復重組盒、著絲粒-自主復制序列、P〇130基因、另一個隔離子序列和另一 個端粒重復序列。
[0016] 上述釀酒酵母人工染色體中，
[0017] 所述端粒重復序列均為序列表中序列1 ;
[0018] 所述隔離子序列均為序列表中序列2 ;
[0019] 所述著絲粒-自主復制序列為序列表中序列4;
[0020] 所述po130基因序列為序列表中序列6 ;
[0021] 所述報告基因為RFP基因；
[0022] 所述篩選標記基因為TRP1基因；
[0023] 所述第一個重復重組盒的上游重組目標序列為序列表中序列9 ;
[0024] 所述第一個重復重組盒的下游重組目標序列為序列表中序列10 ;
[0025] 所述第二個重復重組盒的上游重組目標序列為序列表中序列11 ;
[0026] 所述第二個重復重組盒的下游重組目標序列為序列表中序列12 ;
[0027] 所述第一個重復重組盒的序列為序列表中序列15 ;
[0028] 所述第二個重復重組盒的序列為序列表中序列16。
[0029] 本發明的另一個目的是提供一種釀酒酵母人工染色體的制備方法。
[0030] 本發明提供的釀酒酵母人工染色體的制備方法為將n個重復重組盒整合到 PNE0C14載體中，得到釀酒酵母人工染色體。
[0031] 上述方法中，
[0032] 每個所述重復重組盒由上游重組目標序列、報告基因、篩選標記基因和下游重組 目標序列組成；所述報告基因和所述篩選標記基因均位于所述上游重組目標序列和所述下 游重組目標序列之間；所述n為大于等于1的自然數。
[0033] 上述方法中，所述方法包括如下步驟：將n個重復重組盒轉入含有線性化的 PNE0C14載體的釀酒酵母中，得到重組菌，提取所述重組菌的質粒，即得到釀酒酵母人工染 色體；
[0034] 所述含有線性化的PNE0C14載體的釀酒酵母為將線性化的pNE0C14載體轉入宿主 釀酒酵母得到的中間菌；
[0035] 所述線性化的PNE0C14載體為用限制性內切酶PmeI酶切pNE0C14載體后得到的 線性DNA分子；
[0036] 所述PNE0C14載體的核苷酸序列為序列表中序列7所示的環狀DNA分子。
[0037] 上述方法中，
[0038] 所述n為1或2 ;
[0039] 所述端粒重復序列均為序列表中序列1 ;
[0040] 所述隔離子序列均為序列表中序列2 ;
[0041] 所述著絲粒-自主復制序列為序列表中序列4 ;
[0042] 所述po130基因序列為序列表中序列6 ;
[0043] 所述報告基因為RFP基因；
[0044] 所述篩選標記基因為TRP1基因；
[0045] 所述第一個重復重組盒的上游重組目標序列為序列表中序列9 ;
[0046] 所述第一個重復重組盒的下游重組目標序列為序列表中序列10 ;
[0047] 所述第二個重復重組盒的上游重組目標序列為序列表中序列11 ;
[0048] 所述第二個重復重組盒的下游重組目標序列為序列表中序列12 ;
[0049] 所述第一個重復重組盒的序列為序列表中序列15所示；
[0050] 所述第二個重復重組盒的序列為序列表中序列16所示。
[0051 ] 上述方法中，所述釀酒酵母為基因組上敲除p〇130基因，且含有URA-p〇130質粒的 釀酒酵母JDY52 ;所述URA-p〇130質粒的核苷酸序列如序列表中序列8所示。
[0052] 本發明還有一個目的是提供一種DNA片段。
[0053] 本發明提供的DNA片段為上述重復重組盒。
[0054] 本發明還有一個目的是提供一種含有釀酒酵母人工染色體的酵母菌。
[0055] 本發明提供的含有釀酒酵母人工染色體的酵母菌為將上述釀酒酵母人工染色體 導入釀酒酵母中得到的酵母菌。
[0056] 上述釀酒酵母人工染色體或上述DNA片段或上述含有釀酒酵母人工染色體的酵 母菌在表達外源基因中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0057] 上述釀酒酵母人工染色體或上述DNA片段或上述含有釀酒酵母人工染色體的酵 母菌在制備表達外源基因的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0058] 本發明的最后一個目的是提供一種表達外源基因的方法。
[0059] 本發明提供的表達外源基因的方法包括如下步驟：將含有外源基因的DNA片段導 入上述含有釀酒酵母人工染色體的酵母菌中，得到重組菌A，培養所述重組菌A，實現外源 基因的表達；
[0060] 所述外源基因的DNA片段包括上游同源臂、外源基因表達盒、篩選標記基因和下 游同源臂；
[0061] 所述上游同源臂為所述釀酒酵母人工染色體的重復重組盒的上游重組目標序 列；
[0062] 所述下游同源臂為所述釀酒酵母人工染色體的重復重組盒的下游重組目標序列。
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