一種靶向真菌細胞壁幾丁質合成酶下調劑細胞篩選模型的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及一種靶向真菌細胞壁幾丁質合成酶下調劑高通量 藥物細胞篩選模型。
【背景技術】：
[0002] 幾丁質合成酶是幾丁質生物合成中的關鍵酶，而由微生物產生的幾丁質合成酶抑 制劑能抑制該酶的活性，阻止幾丁質的生物合成，從而抑制真菌生長或阻止昆蟲幼蟲和蛹 蛻皮達到殺蟲效果。由于哺乳類動物沒有幾丁質代謝系統，所以篩選幾丁質合成酶抑制劑， 有望開發出對人、畜低毒無害的新型抗真菌劑和殺蟲劑。
[0003] 在各類幾丁質合成酶中，CS3(IV類）在細胞周期開始時，在細胞出芽位點處合成 幾丁質環；CS2(II類）在有絲分裂末期，在母細胞和子細胞之間合成初級隔膜，而CSl(I 類）則是在細胞分裂后起修復損傷作用；所以在研究中，本發明靶向選擇CS3(IV類）作為 篩選靶標。
[0004] 迄今，已有諸多關于靶向幾丁質合成酶進行真菌藥物篩選模型的報道（鄧喬.重 慶.西南大學研究生院.2014-4-1)，而相關研究多集中于幾丁質酶抑制劑的研究。由于藥 物篩選靶標特異性有限，所述研究篩得的藥物化合物多存在交叉耐藥的問題。本項研究將 篩選靶向鎖定于幾丁質生物合成上游酶基因調控序列，這種全新的構思可以大大提高篩得 幾丁質合成酶抑制劑未來應用的潛能。
【發明內容】
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[0005] 本發明提供一種靶向真菌細胞壁的幾丁質合成酶下調劑高通量篩選模型。所 述的篩選模型由UMc sh5基因啟動子序列UMPRO、攜帶熒光素酶報告基因的重組質粒 Ppic9KG-UMPR0-LUC、穩定表達UMPRO啟動子的單克隆細胞株GS115-UMPR0-LUC、篩選試劑 以及熒光素酶報告基因檢測系統構成。
[0006] 所述的UMcsh5基因是植物真菌致病菌黑粉菌屬Ustilago maydis521chromosome 6中的幾丁質合成酶編碼基因，Genbank號為NC_026483 ;
[0007] 優選地，所述的幾丁質合成酶啟動子序列UMPRO為SEQIDNo: 1所示的DNA序列；
[0008] 優選地，所述的構建重組質粒采用載體Ppic9K ;
[0009] 優選地，所述的篩選試劑包括氨芐青霉素和遺傳霉素。
[0010] 本發明提供的一種靶向真菌細胞壁的幾丁質合成酶下調劑高通量篩選模型，是利 用UMcsh5基因UMPRO啟動子序列作為藥物篩選的靶標，通過UMPRO啟動子-單熒光素酶報 告基因檢測系統，根據熒光素酶作用于其底物所發出生物熒光的強度，判斷UMPRO啟動子 的活性，根據化合物對啟動子的抑制效果，判斷幾丁質合成酶下調活性。所以，本發明所提 供的細胞模型篩選系統，可以高效、高通量地用于不同來源化合物的篩選。能夠抑制UMPRO 啟動子活性，使熒光素酶報告基因表達降低的化合物，即有可能成為抑制幾丁質生物合成 的候選藥物。
[0011] 本發明提供的一種靶向真菌細胞壁的幾丁質合成酶下調劑高通量篩選模型的構 建，包括以下步驟：
[0012] 1?改組載體Ppic9KG的制備
[0013] 將Ppic9k載體經由BgI II與SacI雙酶切處理后，跑膠、純化回收片段長度為 9000bp左右的片段，即得Ppic9KG ;
[0014] 2.UMcsh5基因啟動子序列UMPRO的擴增
[0015]利用NCBIGenbank號為NC_026483UM521 菌中UMcsh5 基因啟動子區序列 1500bp 作為UMcsh5基因啟動子UMPR0。應用primerprimer5.0引物設計軟件，設計UMPRO啟動子 的引物，以人工合成的啟動子序列UMPRO為模板進行PCR，擴增得到的目的片段；
[0016] 3.熒光素酶報告基因（LUC)的擴增
[0017] 應用primerprimer5.0引物設計軟件，設計焚光素酶報告基因（Luc)的引物，以 pGL4. 17 (購置于promega公司）模板進行PCR，擴增得到的目的片段；
[0018] 4.攜帶熒光素酶報告基因的重組質粒的構建
[0019] 將步驟2中的啟動子序列UMPRO經由BgI II與SacI雙酶切處理后，與Ppic9KG 連接后，轉化、提取質粒獲得Ppic9KG-UMPR0重組子；隨后，將步驟3中的熒光素酶報告基因 (LUC)與Ppic9KG-UMPR0重組子經SnaBI和NotI雙酶切后連接、轉化、提取質粒DNA得到重 組質粒Ppic9KG-UMPR0-LUC ;
[0020] 5.穩定表達UMPRO啟動子的單克隆細胞株GS115-UMPR0-Luc的篩選
[0021] 將重組質粒電轉入畢赤酵母細胞GS115中，經不含組氨酸的篩選培養基和含遺 傳霉素的培養基雙篩選，根據熒光素酶報告基因檢測結果，獲取表達強度最高的單克隆細 胞株，擴大培養獲得GS115-UMPR0-LUC單克隆細胞株。
[0022] 6.藥物篩選的應用
[0023] 在GS115-UMPR0-LUC單克隆細胞株培養過程中，加入候選化合物，作用24小時后， 利用并根據熒光素酶報告基因檢測熒光強度，來反應啟動子UMPRO的活性，進而獲得對幾 丁質合成酶啟動子的有抑制作用的化合物。
[0024] 發明優點：
[0025] 1、本發明是一種基于UMcsh5基因啟動子序列UMPRO的幾丁質合成酶下調劑篩選 模型。幾丁質生物合成是真菌細胞中很重要的一個合成路徑，它的缺失在很大程度上會影 響真菌細胞的活性。所以，基于對UMPRO啟動子的活性影響作為靶標，具有很好的實用性；
[0026] 2、本發明所述篩選模型選用穩定表達UMPRO啟動子活性的單細胞菌株，篩選結果 具有均一、可靠、高效迅速、操作簡便的特點，能夠滿足高通量篩選的要求；
[0027] 3、本發明所述篩選模型是選用熒光素酶作為報告基因，通過該檢測系統，依據熒 光素酶強度反應啟動子UMPRO的活性，進而顯示化合物對幾丁質合成酶啟動子的抑制作 用，靈敏度高、效果直觀；
[0028] 4、本發明所述篩選模型可應用于不同化合物，包括天然化合物、合成化合物、有機 小分子、無機小分子、糖類、脂類中的一種或幾種，其應用范圍廣、篩選效率高、成功幾率大。
[0029] 5、本研究中將篩選靶向鎖定于幾丁質合成酶的上游調控序列，不同于目前對幾丁 質酶抑制劑的研究，全新的構思可大大提高獲得幾丁質生物合成抑制劑應用的潛能。
【附圖說明】：
[0030]圖I-Ppic9KG_UMPR0-LUC重組質粒的構建
[0031] 圖2 -GS115-UMPR0-LUC單克隆細胞株熒光素表達強度的檢測
[0032] 圖3-化合物Fl-FlO相對熒光素酶檢測結果
[0033] 實施方式：
[0034] 以下結合附圖和實施例對本發明進行詳細描述，但所述內容是對本發明的解釋 而不是限定。
[0035]《實施例1》Ppic9kG-UMPR0_LUC重組質粒的構建
[0036] 1.1引物設計
[0037]UMPRO-F：GAAGATCTTGTAGCATGTACCTTGGTCGAGCCA
[0038]UMPRO-R：CGAGCTCAGCAAGCGAAAAGCCTCCCATG
[0039]LUC-F：TACGTAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA
[0040]LUC-R：ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTTAGACGTTGATCCTGGCGCTG
[0041] 1. 2改組載體Ppic9KG的獲得
[0042] 將Ppic9K載體（購置于Invitrogen)經由BgIII與SacI(購置于Takara)雙酶 切處理后，跑膠、純化回收片段長度為9000bp左右的片段，即得改組載體，命名為Ppic9KG;
[0043]I. 3UMcsh5基因啟動子序列UMPRO的獲取
[0044]利用NCBIGenbank號為NC_〇26483Ustilagomaydis52lchromosome6 中的UMcshf5 基因前啟動子區序列約1500bp，應用primerprimer5. 0引物設計軟件，設計UMPRO啟動子 的引物UMPRO-F和UMPR0-R，以人工合成的啟動子序列UMPRO(委托中美泰和生物技術有限 公司合