一株同時生產甲醇蛋白和脂肪酶的畢赤酵母及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程領域，特別是一株同時生產甲醇蛋白和脂肪酶的畢赤酵母及其應用。
【背景技術】
[0002]脂肪酶是一類主要水解由甘油和水不溶性長鏈脂肪酸形成的甘油三酯的酯鍵水解酶，廣泛應用于食品加工、新型生物材料、生物醫學、手性藥物拆分等領域。在焙烤食品中應用脂肪酶具有強筋、改善面團結構紋理及面包品質的作用。脂肪酶的乳脂水解作用可改善乳品品質，可于增強奶酪和奶粉風味、奶酪熟化、奶油及冰淇淋的酯解改性等；脂肪酶在藥業中主要用于助消化、降血脂，亦可用于臨床診斷脂血病、胰腺炎等疾病。
[0003]甲醇蛋白是以工業甲醇為原料生產的單細胞蛋白，被稱為第二代單細胞蛋白。它是通過微生物以甲醇為主要營養源進行生長、繁殖而得到的菌體蛋白。與天然蛋白相比，單細胞甲醇蛋白的粗蛋白含量比魚粉和大豆都要高，含有豐富的必需氨基酸、礦物質和維生素，營養價值極高，可用于部分代替魚粉、大豆、骨粉、肉類和脫脂奶粉而應用于畜禽飼料或其他化工領域。相對于其他方法生產的單細胞蛋白來講，甲醇蛋白具有資源豐富、生產不受氣候條件影響、合成速度快、質量穩定等特點。
[0004]我國蛋白飼料供需缺口每年達幾千萬噸，隨著人民生活水平的提高及養殖業的發展，飼料蛋白的供需矛盾進一步加劇。單細胞甲醇蛋白中的粗蛋白含量比魚粉和大豆都要高，含有豐富的必需氨基酸、礦物質和維生素，營養價值極高，是一個十分重要且具有發展前景的產品。而目前的甲醇蛋白生產中存在的產品單一，發酵工藝陳舊，成本高而效益低的難題；脂肪酶作為生物酶制劑，反應條件溫和，催化效率高，被廣泛用于食品、發酵、制革、醫藥、日化、飼料等工業，兩者如能同時生產，不但簡化了生產工藝，還可以降低原料消耗，節約能源使用，減輕環境污染，但是，目前尚未見同時聯合發酵生產脂肪酶與甲醇蛋白的有關報道。
【發明內容】
[0005]針對上述情況，本發明的目的就是提供一株同時生產甲醇蛋白和脂肪酶的畢赤酵母及其應用，可有效解決現有甲醇蛋白生產中存在的產品單一，發酵工藝陳舊，成本高而效益低的難題。
[0006]本發明解決的技術方案是，一株同時生產甲醇蛋白和脂肪酶的畢赤酵母，分類命名為巴斯德畢赤酵母(/3ZcAia pas tor is) zfwx-208菌株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0.M2013518，保藏日期為:2013年10月30日，保藏地址為:中國武漢市武漢大學中國典型培養物保藏中心；
一株同時生產甲醇蛋白和脂肪酶的畢赤酵母的應用，具體步驟如下:
(I) 一級種子的培養:取試管斜面保藏的菌株zfwx-208 (即巴斯德畢赤酵母zfwx-208菌株)，接入至一級種子培養基上，在30 °(:搖床中振蕩培養22-26小時，搖床轉速為200-300rpm,獲得一級搖瓶種子；
(2)二級種子的培養:每升無機鹽培養基中加入4mL的微量元素溶液后，再調整pH值到5.0，將一級搖瓶種子接種到加入微量元素溶液后的無機鹽培養基上，在30-32°C，pH5.0，通氣量0.5-1.2v/v.m (每分鐘氣液比)，攪拌轉速400-650rpm，培養時間22_26h ；
(3)高密度發酵:
A、在發酵罐中裝入發酵培養基和聚醚改性硅消泡劑，發酵培養基和聚醚改性硅消泡劑的體積比為7500:1，對發酵培養基加熱，使發酵培養基溫度上升至121-123°C，保持罐壓1.1-1.4MPa，滅菌30分鐘，滅菌結束后，對發酵罐中的發酵培養基進行冷卻，當發酵培養基溫度降至35°C時，向發酵罐中補加微量元素溶液，并調pH至5.0，微量元素溶液和發酵培養基的體積比為1:25 ;所述的發酵培養基為無機鹽培養基；
B、將培養好的二級種子接入到A步驟發酵罐中的發酵培養基上，在溫度30-32°C，通氣量為0.6?0.8ν/ν.ηι，攪拌轉速為60_80rpm的條件下進行培養，每隔4小時取樣測定發酵液中菌體濕重，當濕重達到60g/L以上后，通氣量加大至1.0?1.5ν/ν.ηι，攪拌轉速提高到85-100rpm，保持發酵液ρΗ5.0，16-20小時后，開始以20_30Kg/h的速度流加甘油，當發酵液中菌體濕重達到140g/L時，停止甘油流加，當甘油利用完后，發酵罐上溶氧電極顯示溶氧上升，開始流加甲醇，發酵液中甲醇體積濃度控制在0.8%?1.2%，同時開大發酵罐進氣閥門，保證發酵液中溶氧達到30%以上(以攪拌轉速為lOOrpm，進氣量為2m3/min定義為溶氧100%)；
(4)誘導產酶:甲醇流加24-30h后，降低發酵溫度至25°C，降低發酵液pH至4.0-4.5，每隔3-4小時流加發酵液體積的0.5-0.6%。的微量元素溶液，當發酵液中菌體濕重達到400-450g/L時，酶活性達到20000U/mL且不再增長(其中，不再增長的判斷標準是，當酶活性比前一次酶活性增長量低于5%時，即為不再增長)，收集發酵液；
(5)酶的提取:
a、利用蝶片離心機對上述(4)步驟收集的發酵液進行分離，蝶片離心機轉速12000rpm，進液量500L/h，分別收集輕相(即上清液，又稱酶液)和重相(即單細胞甲醇蛋白菌體);
b、重相加重相體積I倍的清水，攪拌均勻，再次進行離心分離，分別收集上清液和重相，上清液與上述a步驟收集的上清液合并；經截留分子量5000KU的超濾膜濃縮，獲得脂肪酶濃縮液，收集到酶液儲存罐中，投加玉米淀粉，玉米淀粉投加量(g)=脂肪酶濃縮液總酶活(U) /計劃固體酶活性(U/g);其中，脂肪酶濃縮液總酶活指單位體積(mL)脂肪酶濃縮液的酶活性與脂肪酶濃縮液總體積的乘積，計劃固體酶活性指準備生產得到的固體酶活性，攪拌均勻，輸送到噴霧干燥機中進行干燥，重相備用；
(6)酶液噴霧干燥:調節噴霧干燥機進風口溫度至135?155°C、出風溫度至60-75°C，調節進料流量為500L/h，噴霧干燥結束后，收集干粉即為脂肪酶；
(7)單細胞甲醇蛋白的獲得:將上述(5)中b步驟收集的重相即單細胞甲醇蛋白懸液，加入清水，懸液中菌體為700-750g/L，送入噴霧干燥機，調節噴霧干燥機進風口溫度至135?155°C、出風溫度至60-75°C，調節進料流量為400_500L/h，進行噴霧干燥，噴霧干燥結束后，收集的干粉即為單細胞甲醇蛋白；
所述的一級種子培養基為Yro培養基，是由重量百分比計的酵母浸膏1% (Ox1d公司產品，公知技術，以下同)、胰蛋白胨2%、葡萄糖2%和余量的水混合在一起組成；
所述的無機鹽培養基是由磷酸氫二銨5.16g、石膏粉0.22g、硫酸鉀8.12g、硫酸亞鐵
0.42g，七水硫酸鎂6.5g、氯化鉀1.68g、甘油40g和質量濃度98%的硫酸5mL加水至IL制成，用氨水調pH值至5.0 ；
所述的微量元素溶液是由五水硫酸銅2.2g，碘化鉀0.08g，一水硫酸錳4.5g，二水鉬酸鈉0.3g，硼酸0.02g，六水合氯化鈷0.1g,氯化鋅8g，七水合硫酸亞鐵32g，質量濃度98%的濃硫酸3mL和生物素0.2g加水至IL制成。
[0007]本發明將菌株zfwx-208在發酵培養基中分別以甲醇和氨水作為主要碳源和氮源進行生長和產酶，通過脂肪酶與甲醇蛋白(即單細胞甲醇蛋白)聯合發酵生產，實現了裝置多用，降低了生產成本，提高了生產效益，并且簡化了生產工藝，降低原料消耗，節約能源使用，減輕環境污染。
【具體實施方式】
[0008]以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
實施例
[0009](I)一級種子的培養:一級種子培養基米用YPD培養基，用2000mL三角瓶分裝，每瓶裝液量為500mL，瓶口用8層紗布包裹，121°C滅菌30min后冷卻備用，取3_5支試管斜面保藏的菌株zfwx-208 (又稱試管斜面)，用接種環刮下并接入至有500mL —級種子培養基的三角瓶中，每支試管斜面接種兩瓶，接種后在30°C搖床中振蕩培養22-26小時，搖床轉速為200-300rpm,獲得一級搖瓶種子；
(2)二級種子的培養:二級種子培養基采用無機鹽培養基，121°C滅菌30min后冷卻