Gdsl蛋白在制備脂肪酶中的新用途的制作方法

專利名稱：Gdsl蛋白在制備脂肪酶中的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及⑶SL蛋白在制備脂肪酶中的新用途。
背景技術：
脂肪酶(lipase,triacylglycerolacylhydrolases,EC3. I. I. 3)即三酸基甘油酰基水解酶，是工業酶制劑中最重要的酶類之一，能夠在油水界面催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯，同時還能催化酯交換、轉酯、酯合成、醇解、酸解、氨解等多種化學反應，通常具有催化效率高、催化條件簡單的優點。目前工業上應用的脂肪酶大多為微生物產生的胞外酶，從反應溫度來說多為中溫酶(最適反應溫度37-40°C )，在高溫下反應受到限制。嗜熱酶是指最佳催化溫度60-85°C的酶，具有化學催化劑無法比擬的優點，如催化效率高、作用溫度廣泛(在高溫下的穩定性也 較好)、作用PH廣泛等，因而能克服中溫酶(20-55°C )及低溫酶(2-20°C )在應用過程中出現的生物學性質不穩定的現象，可以取代傳統的中溫酶催化及化學催化，為優化工藝流程開辟了一條新途徑。利用熱穩定性好的脂肪酶作為生物催化劑具有如下優點⑴由于該脂肪酶的穩定性高，可在室溫下分離提純和包裝運輸、并能長久保持活性，從而制備脂肪酶的成本降低；(2)對反應器冷卻系統的要求標準低，從而減少了能量消耗，且由于其耐高溫特性，在生產中不需要復雜的冷卻裝置，既節省了開支又降低了冷卻過程對環境造成的污染；(3)隨反應溫度的提高，酶分子運動速度加快，催化能力加強，加快了動力學反應，從而使用效率得到了提高；(4)由于采用高溫反應條件，降低了中溫微生物污染反應體系的危險，從而提高了產物純度，同時高溫反應條件還提高了有機化合物的生物可利用性和可溶性，從而實現了有效的生物修復。脂肪酶的熱穩定性問題一直是脂肪酶研究及生產和應用的瓶頸問題，就目前脂肪酶的研究現狀來看，僅通過蛋白質工程來改善脂肪酶特性，遠不能解決各個領域對脂肪酶的要求。因此，尋找發現具有新特性、耐熱、高活力、符合現代生物工程要求的脂肪酶是一項非常有意義的工作。

發明內容
本發明的目的是提供GDSL蛋白在制備脂肪酶中的新用途。本發明提供了⑶SL蛋白的應用，為如下(I)或(2)(I)制備脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物；所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質。應用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物時，所述降解的反應條件為30-80 V、pH6. 5-8. O，所述降解的反應條件優選為65°C、pH7. 5。所述脂肪酶的底物為對硝基苯基乙酸酯、丁酸對硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕櫚酸酯中的至少一種。本發明還保護將重組質粒導入大腸桿菌得到的重組菌；所述重組質粒為將所述⑶SL蛋白的編碼基因插入載體pET-28a(+)的多克隆位點得到的重組質粒。所述⑶SL蛋白的編碼基因具體可為如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的 DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子。所述大腸桿菌優選為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發明還保護一種制備⑶SL蛋白的方法，是培養以上所述的重組菌，得到所述⑶SL蛋白。所述方法中，所述培養的具體步驟為將重組菌接種至LB液體培養基(含100 μ g/mL卡那霉素)，振蕩培養至0D_達到O. 8，然后加入IPTG (誘導劑)至濃度為Immo/L，20°C、200rpm振蕩培養12小時。所述方法中，在培養重組菌后還包括超聲破碎和將超聲破碎的上清進行親和層析的步驟。所述超聲破碎的具體參數為功率300W、總工作時間90min,每工作5s間歇8s), 12000rpm離心IOmin,收集上清液。所述親和層析具體可為鎳柱親和層析。本發明還保護一種降解脂肪酶的底物的方法，是采用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物。所述降解的反應條件為30-80°C、pH6. 5-8. O。所述降解的反應條件優選為65°C、pH7. 5。所述脂肪酶的底物具體可為對硝基苯基乙酸酯、丁酸對硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕櫚酸酯中的至少一種。本發明發現所述GDSL蛋白具有脂肪酶活性，將所述GDSL蛋白用作脂肪酶，具有如下優點可以采用較高的反應溫度；具有良好的熱穩定性；可以在堿性條件下作用；具有良好的PH穩定性；對02-(12的底物均可發揮作用；酶活力較高。本發明為涉及脂肪酶的工藝流程開辟了一條新途徑，具有重大的經濟價值。


圖I為實施例I中60°C培養條件下復篩獲得脂肪酶菌株。圖2為實施例I中各個菌株的酶活初測結果。圖3為⑶SL蛋白的三維結構預測圖。圖4為重組質粒pET_28a - B2的結構示意圖。圖5為在大腸桿菌中誘導表達⑶SL蛋白的SDS-PAGE ;1、分子量標記，2、對照菌得到的上清液、3、重組菌得到的上清液。圖6為對硝基苯酚一吸光度標準曲線。圖7為純化后蛋白的電泳圖。圖8為目的蛋白的質譜鑒定結果。
圖9為實施例3中的最適pH及pH穩定性測定結果。圖10為實施例3中的最適溫度及熱穩定性測定結果。圖11為實施例3中各個試劑對酶活的影響。圖12為實施例3中各個有機溶劑對酶活的影響。圖13為實施例3中去污劑對酶活的影響。圖14為實施例3中蛋白酶對酶活的影響。 圖15為實施例4中對不同碳鏈長度底物特異性。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。載體pET-28a(+) :Novagen，GR201023。大腸桿菌BL21 (DE3):北京全式金生物技術有限公司，CD601-01。對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP) :Sigma，1492-30-4。對硝基苯酚(PNP)Sigma,4043-96-3。CHAPS 的英文全稱為 3-[ (3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate )。實施例I、野生菌的獲得以及脂肪酶的發現一、產脂肪酶菌株篩選初篩培養基(g/L)=(NH4)2SO4 lg、NH4N03 lg、NaCl lg、MgS04 ·7Η20 0. lg、K2HP03lg、FeSO4 · 7Η20 O. Olg、Na2CO3 調 PH 至 8. O,再加 I. 0% 橄欖油，滅菌。液體發酵培養基(g/L):可溶性淀粉10g、(NH4)2SO4 5g、K2HPO3 lg、玉米漿粉20g、黃豆餅粉20g、三油精10g，pH8. O。初篩池塘底泥樣品取自浙江嘉興欣欣飼料有限公司的混養魚池塘，取樣時間為2009年7月，4°C條件保存樣品。將池塘底泥樣用無菌PBS緩沖液進行十倍梯度稀釋，取100微升涂布于初篩培養基，放于60°C溫度下進行培養，產脂肪酶菌株能夠降解橄欖油產生透明圈，依據產生透明圈直徑和菌落直徑比值大的甄別其脂肪酶活性強弱。復篩將分離純化的具有脂肪酶活性的菌株接種入復篩固體(復測產真脂肪酶菌株)或液體發酵培養基(誘導產酶測活性)，固體平板放入30或60°C溫度下進行培養，觀察降解透明菌。通過高溫篩選策略和羅丹明橄欖油篩選方法初步獲得26株耐高溫脂肪酶產生菌，再通過三油精復篩策略獲得12株菌顯示出較大透明圈。60°C培養條件下復篩獲得脂肪酶菌株見圖I。其中B2、B6、B9、B12為高溫培養條件篩選到的脂肪酶菌。采用液體發酵培養基在200r/min，60°C搖床培養48h。將菌體12，OOOrpm離心2min，取上清，將菌體重懸于50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液中，用超聲波破碎儀破碎細胞(4s/次，間隔10s，破碎30次)，13，000rpm，4°C離心lOmin，即得菌體胞內酶上清。將上清進行酶活初測。通過對胞外及胞內酶活測定發現篩選獲得的細菌菌株胞外檢測到的酶活均高于胞內酶活。酶活初測結果見圖2。取酶活最高的B2菌株進行后續試驗。二、菌株的鑒定提取B2菌株基因組DNA，并采用16S rDNA通用引物27F和1492R進行16S rDNA的 PCR 擴增。27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R :5’ -TACCTTGTTACGACTT-3，。反應體系10X PCR buffer 5 μ L, dNTP mix (2. 5mmol/L) 4 μ L、Taq (5U/μ L)0. 5 μ L、27F(25 μ mol/L) I μ L、1492R(25 μ mol/L) I μ L、模板 DNA I μ L、ddH20 8 μ L、總體積50 μ L0PCR 反應條件95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，32 個循環后；72°C延伸 IOmin0測序所得16S rDNA基因序列長度大約1500bp，如序列表的序列I所示。將菌株的16S rDNA基因序列在GenBank核酸數據庫進行比對與Geobacillus toebii (EU391540)具有較高相似性，初步判斷其屬于Geobacillus sp.。三、脂肪酶的發現
從B2菌株中發現一個蛋白，具有脂肪酶的功能，將其命名為GDSL蛋白，如序列表的序列2所示。將編碼GDSL蛋白的基因命名為GDSL基因，其開放閱讀框如序列表的序列
3所示。⑶SL蛋白的三維結構預測圖見圖3。實施例2、⑶SL蛋白的制備一、重組表達載體的構建I、合成序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子。2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用B2F和B2R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。B2F: 5 ’ -GACGAATTCATGAGACGCGGTATTGTAAGCAC-3’ (下滑線標注限制性內切酶EcoRI的酶切識別序列);B2R: 5 ’ -GACGCGGCCGCTTGTTTGTCCTCCTCCGTCCAC-3’ (下劃線標注限制性內切酶NotI的酶切識別序列)。PCR 反應條件95°C預變性 5min ；94°C 30sec、60°C 30sec、72°C lmin, 30 個循環；最后72°C延伸lOmin。3、用限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。4、用限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切載體pET_28a(+)，回收載體骨架(約5300bp)。5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pET_28a - B2。根據測序結果，對重組質粒pET-28a - B2進行結構描述如下在載體pET_28a(+)的EcoRI和NotI酶切位點之間插入了序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的雙鏈DNA分子(插入的雙鏈DNA分子的3’末端與載體上的His標簽編碼基因融合，以便于進行后續的蛋白純化)。重組質粒pET-28a - B2的結構示意圖見圖4。二、重組菌的構建將重組質粒pET_28a - B2導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌。將載體pET_28a(+)導入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到對照菌。三、⑶SL蛋白的表達和鑒定I、將重組菌或對照菌接種至5mL LB液體培養基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振蕩培養過夜。2、將步驟I的菌液以1/100的體積比接種至20mL LB液體培養基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振蕩培養至OD6tltl達到O. 6 ;然后加入IPTG (誘導劑)至濃度為lmmo/L，20°C、200rpm 振蕩培養 12 小時。3、取步驟2得到的菌液離心并收集菌體，然后將菌體進行超聲破碎(功率300W、總工作時間90min,每工作5s間歇8s), 12000rpm離心lOmin,收集上清液。4、將重組菌步驟3得到的上清液和對照菌步驟3得到的上清液進行SDS-PAGE，結果見圖5。重組菌得到的上清液中具有分子量約為29. 5kD的預期蛋白條帶，而對照菌得到的上清液不顯示該蛋白條帶。將目的蛋白從SDS-PAGE上切下來，送天津生物芯片技有有限公司進行一級質譜鑒定。結果表明，該蛋白確實為序列表的序列2所示的GDSL蛋白。5、將重組菌步驟3得到的上清液和對照菌步驟3得到的上清液分別作為待測溶液進行脂肪酶酶活檢測。
采用對硝基苯酚制作標準曲線，見圖6。標準曲線方程為y=57. 548x-0. 9233，R2=O. 9993，y代表酶活(單位為μ mol/min), x代表采用分光光度計測定得到的405nm光吸收值。通過脂肪酶將對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP)降解為黃色的對硝基苯酚(PNP)原理，采用分光光度法檢測待測溶液(或其稀釋液)的脂肪酶活性。具體操作過程如下將試管中按順序加入I. 8mL溶液B和O. ImL溶液A，37°C水浴保溫5min ;將試管分為對照管和樣品管，對照管中加入已高溫煮沸滅活的待測溶液(或其稀釋液)0. ImL并混勻，樣品管中加入待測溶液(或其稀釋液)O. ImL并混勻，立即計時，37°C反應IOmin后每個試管加入ImL 95%乙醇水溶液以終止反應；采用分光光度計測定405nm光吸收值。溶液A :稱取90mg對硝基苯酚棕櫚酸酯溶于30mL異丙醇。溶液B 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. O)。I個酶活單位脂肪酶的定義在pH8. 0、37°C條件下，每分鐘釋放I μ mo I對硝基酚所需要的酶量。酶活計算公式A=([At-A0] XK+C0) XVlXn/(V2Xt)A 一待測溶液的酶活(U/mL)，At 一反應后樣品管的光吸收值，A0 一反應后對照管的光吸收值，K=57. 4，Co=O. 9233，η 一稀釋倍數，Vl 一反應液的體積(2mL)，V2 一加入試管的待測溶液(或其稀釋液)的體積(O. ImL), t 一反應時間(lOmin)。重組菌步驟3得到的上清液的酶活為4. 48U/mL,對照菌步驟3得到上清液的酶活為 OU/mL。四、⑶SL蛋白的表達和純化I、將重組菌接種至50mL LB液體培養基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振蕩培養過夜。2、將4mL步驟I的菌液接種至200mL LB液體培養基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振蕩培養至OD6tltl達到0. 8 ;然后加入IPTG (誘導劑)至濃度為lmmo/L，20°C、200rpm振蕩培養12小時。3、取步驟2得到的菌液離心并收集菌體，然后將菌體進行超聲破碎(功率300W、總工作時間90min,每工作5s間歇8s), 12000rpm離心lOmin,收集上清液。4、將步驟3得到的上清液進行親和層析(鎳柱)。采用ImL 的 NTA 柱。洗脫過程中的緩沖液(pH均為 7. 6)如下ΝΤΑ-0 :含 20mmol/L Tris-HCl.O. 5mol/LNaCl 和 10g/100mL 甘油；NTA_60 :含 20mmol/L Tris-HCl、60mmol/L 咪唑、O. 5mol/LNaCl和 lOg/lOOmL 甘油；NTA-200 含 20mmol/L Tris-HCl、200mmol/L 咪唑、0. 5mol/LNaCl 和lOg/lOOmL 甘油。洗脫過程(1)柱子用10_20mL水平衡，每次加5mL待流凈后再加，以后皆同；(2)用NTA-O平衡15-20mL，然后上樣5mL步驟3得到的上清液；(3)用5mL NTA-60進行洗脫，以去除雜蛋白；(4)用5mL NTA-200洗脫目的蛋白，收集過柱后的溶液，即為⑶SL蛋白液。5、將步驟4得到的⑶SL蛋白液進行SDS-PAGE，結果見圖7。結果表明，親和層析后得到了電泳純的GDSL蛋白。6、切下步驟5中的目的條帶并進行質譜氨基酸測定，結果見圖8，結果表明該目的蛋白確實為序列表的序列2所不的GDSL蛋白。實施例3、⑶SL蛋白作為脂肪酶的性質鑒定 采用實施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液進行實施例3的各個實驗。—、最適pH及pH穩定性測定I、最適 pH檢測⑶SL蛋白液的最適pH，方法參見實施例2的步驟三的5，差異僅在于采用不同的緩沖液作為溶液B，分別采用如下緩沖液pH2. 0-3. 6的50mmol/L Gly-HCl緩沖液、pH3. 6-5. O 的 50mmol/L HAc-NaAc 緩沖液、ρΗ5· 0-8. O 的 50mmol/L 檸檬酸-Na2HPO4 緩沖液、pH8. 0-9. O 的 50mmol/L Tris-HCl 緩沖液和 ρΗ9· 0-12. O 的 50mmol/L Gly-NaOH 緩沖液。采用pH7. 5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液作為溶液B時酶活最高，將該最高酶活作為100%，計算采用其它緩沖液作為溶液B的條件下的相對酶活，部分結果見圖9(a)。圖9(a)中，PH8. O的點為Tris-HCl緩沖液，ρΗ9· O的點為Gly-NaOH緩沖液。結果表明，⑶SL蛋白作為脂肪酶的最適pH為7. 5，在pH6. 5-8.0范圍內酶活性可以維持在60%以上，pH在5以下或9以上時沒有酶活檢出。2、pH 穩定性預處理將I體積份⑶SL蛋白液與10體積份不同緩沖液混合，37°C處理60min。分別采用如下緩沖液pH3. 0-5. O的50mmol/L HAc-NaAc緩沖液、pH5. 0-8. O的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4 緩沖液、pH8. 0-9. O 的 50mmol/L Tris-HCl 緩沖液和 pH9. 0-12. O 的 50mmol/L Gly-NaOH 緩沖液。將預處理后的蛋白液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5，差異僅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。采用PH12. O的Gly-NaOH緩沖液進行預處理時酶活最高，將該最高酶活作為100%，計算采用其它預處理條件下的相對酶活，部分結果見圖9(b)。圖9 (a)中，pH5.0的點為檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，pH8. O的點為Tris-HCl緩沖液，pH9. O的點為Gly-NaOH O緩沖液。結果表明，⑶SL蛋白在pH 4.0- 12. O范圍內較穩定，剩余酶活性能保持70%以上，隨著pH值增加該酶越穩定,說明此酶在中性及堿性條件下具有較好的pH穩定性。二、最適溫度及熱穩定性測定I、最適溫度將GDSL蛋白液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5，差異僅在于采用PH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液并且采用不同的反應溫度(20_80°C )。
采用65°C進行反應時酶活最高，將該最高酶活作為100%，計算采用其它反應溫度下的相對酶活，結果見圖10 (a)。結果表明，GDSL蛋白作為脂肪酶的最適反應溫度為65°C，并且在30-80°C間具有較高的活性，保持50. 0%以上的活性；OTSL蛋白作為脂肪酶在30-65°C時隨著反應溫度的增加酶活性亦隨之增加，反應溫度超過65°C后酶活呈下降趨勢，當反應溫度80°C，剩余酶活為62. 0%。2、熱穩定性預處理，將⑶SL蛋白液在不同溫度下處理3小時，并分別于O. 5、I、2、3小時取樣，
立即置在冰水上。將預處理后的蛋白液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5，差異僅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。
將不進行預處理的酶活作為100%，將該最高酶活作為100%，計算采用各個預處理溫度條件下的相對酶活，結果見圖10 (b)。結果表明，⑶SL蛋白在60-80°C處理3h后剩余酶活達60%以上，在60°C條件下酶活幾乎不受影響高達92%，90V處理后酶活可達47%，表明⑶SL蛋白是高溫脂肪酶。三、不同金屬離子及相關化學試劑對酶活的影響在反應體系中加入不同試劑(金屬離子或化學試劑)，來檢測試劑對酶活性的影響，方法參見實施例2的步驟三的5，差異僅在于采用PH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。試劑在反應體系中終濃度為ImmoI/L或IOmmoI/L。以不加入試劑的反應體系作為對M(CK)0以CK處理組的酶活作為100%，計算各個處理組的相對酶活，結果見圖11。在低濃度(ImM)時，Zn2+和β巰基乙醇對GDSL蛋白的脂肪酶酶活有激活作用，而其它金屬離子的影響不明顯。IOmM濃度下，Zn2+、K+、Li+、Na+和β巰基乙醇對⑶SL蛋白的脂肪酶酶活有激活作用，其它離子對GDSL蛋白的脂肪酶酶活都會有不同程度的抑制作用，而Ca2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Mn2+和Pb2+的抑制效果最明顯，剩余酶活均低于30%。四、有機溶劑對酶活的影響預處理在⑶SL蛋白液中加入不同有機試劑(體積百分含量為10%或30%)，40 °C反應lOmin。以加入等體積水的反應體系作為對照(CK)。將預處理后的蛋白液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5，差異僅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。以CK處理組的酶活作為100%，計算各個處理組的相對酶活，結果見圖12。在濃度10%時，甲醇、異丙醇和正辛醇對GDSL蛋白的脂肪酶酶活有微弱地激活作用，異丁醇具有抑制作用，其它有機溶劑對酶活幾乎無影響。在濃度30%時，甲醇、異丙醇和正辛醇對GDSL蛋白的脂肪酶酶活仍具微弱地激活作用，異丁醇和乙醇對酶活有較強的抑制作用，其它有機溶溶劑對酶活仍無影響。五、不同去污劑對酶活的影響預處理在⑶SL蛋白液中加入不同去污劑(使去污劑的質量百分含量為O. 01%或O. 10%)，40°C反應lOmin。以加入等體積水的反應體系作為對照(CK)。將預處理后的蛋白液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5，差異僅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。
以CK處理組的酶活作為100%，計算各個處理組的相對酶活，結果見圖13。CTAB在低濃度或高濃度時均對GDSL蛋白的脂肪酶酶活具有激活作用，可提高酶活約20%。O. 1%的Txrion 100和PTTO對⑶SL蛋白的脂肪酶酶活有微弱地抑制作用，但是剩余酶活仍達80%以上。其它表面活性劑對酶活幾乎無影響。六、抗蛋白酶能力測定預處理在⑶SL蛋白液中加入不同的蛋白酶，處理2小時。蛋白酶為胰蛋白酶時，加入劑量為150U，處理條件為pH 7.0、25°C。蛋白酶為蛋白酶K時，加入劑量為10U，處理條件為pH7. 5、37°C。蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶A時，加入劑量為5U，處理條件為pH 7.5，37 °C ο蛋白酶為胃蛋白酶時，加入劑量為18U，反應條件為pH 2.0，37°C。當蛋白酶為α-糜蛋白酶時，加入劑量為10U，反應條件為pH 7. 5，25°C。將預處理后的蛋白液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5，差異僅在于采用PH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。設置不進行預處理的對照(CK)。 以CK處理組的酶活作為100%，計算各個處理組的相對酶活，結果見圖14。⑶SL蛋白經蛋白酶K、胃蛋白酶、糜蛋白酶、枯草蛋白酶和胰蛋白酶和處理后仍具有60%以上的脂肪酶活性，說明該酶具有一定的蛋白酶抗性。實施例4、GDSL蛋白作為脂肪酶對不同鏈長底物特異性的測定將實施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液作為待測溶液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5，差異如下(I)制備溶液A時，用其它底物取代對硝基苯酚棕櫚酸酯并使底物濃度為ImM ; (2)采用pH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。各個底物如下4_Nitrophenyl acetate (C2,對硝基苯基乙酸酯，SigmaN8130)、4_Nitrophenyl butyrate (C4, 丁酸對硝基苯酯，Sigma N9876)、4_Nitrophenylcaproate (C6,己酸對硝基苯酷，Sigma 956-75-2) 4_Nitrophenyl caprylate (C8，4_ 硝基苯基辛酸酷，Sigma 21742)、4_Nitro phenyl decanoate (CIO, 4-硝基苯基奏酸酷，SigmaN0252)、4_Nitrophenyl dodecanoate (C12, 4_ 硝基苯基月桂酸酷，Sigma61716)。當底物為4-Nitrophenyl acetate時，⑶SL蛋白液的酶活為166U/mL。當底物為4-Nitrophenyl butyrate時，⑶SL蛋白液的酶活為190U/mL。當底物為4-Nitrophenyl caproate時，⑶SL蛋白液的酶活為246U/mL。當底物為4-Nitrophenyl caprylate時，⑶SL蛋白液的酶活為297U/mL。當底物為4-Nitrophenyl decanoate時，⑶SL蛋白液的酶活為231U/mL。當底物為4-Nitrophenyl dodecanoate 時，GDSL 蛋白液的酶活為 109U/mL。以4-Nitrophenyl caprylate作為底物得到的酶活結果作為100%,計算采用其它底物的相對酶活。結果見圖15。GDSL蛋白最大可降解鏈長為C12個碳鏈，在底物為C2-C8時降解能力隨著鏈長的增加活性也相應地增加，底物為C2時相對活性達到56%。底物的鏈長大于C8后降解活性隨之下降，ClO時為78%，C12時為37%。實施例5、重組酶動力學常數測定將實施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液作為待測溶液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5,差異如下(I)制備溶液A時,用4-Nitrophenyl caprylate (或4-Nitrophenyl decanoate)取代對硝基苯酹棕櫚酸酯并使其濃度為ImM ； (2)采用pH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液；(3)依次在2、3、5、7、10、15、20、30min時終止酶活反應，并測定光吸收值。通過計算酶活性與反應時間的比值大小，如該酶在某個時間段內比值不變時，則在該時間段內的酶促反應為一級反應，來確定此時間內為測Km和Vmax的反應最佳時間。根據確定的一級反應時間,4-Nitrophenyl caprylate測定Km值及Vmax的反應時間為 lOmin, 4-Nitrophenyl decanoate 測定 Km 值及 Vmax 的反應時間為 lOmin。將實施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液作為待測溶液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5，差異如下(1)制備溶液A時，用不同量的4-Nitrophenylcaprylate (或4-Nitrophenyl decanoate)取代對硝基苯酌·棕櫚酸酯,使其濃度為1、0.8、O. 4、O. 2、O. 15 或 O. ImM ; (2)采用 ρΗ7· 5 的 50mmol/L 檸檬酸-Na2HPO4 緩沖液；(3)采用前段確定的反應時間。通過公式計算出反應速度，采用米氏方程雙倒數方法求得Km值及Vmax。再按雙倒 數作圖法(Lineweaver-Burk法)來轉化其結構式
「01411 I[m V I I IGDSL 蛋白對 C8 底物的 Kni=O. 26mmol/L, Vmax=149. 25 μ mol/min/mg。GDSL 蛋白對CIO 底物的 Km=O. 41mmol/L, Vmax=71. I μ mol/min/mg。實施例6、重組酶B2比活的測定比活力單位的定義為每毫克酶蛋白所含的酶活力單位。將實施例2的步驟四的4制備的GDSL蛋白液作為待測溶液進行酶活測定，方法參見實施例2的步驟三的5,差異如下(I)制備溶液A時,用4-Nitrophenyl caprylate取代對硝基苯酚棕櫚酸酯，使其濃度為ImM ; (2)采用pH7. 5的50mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。通過伯樂公司的蛋白定量試劑盒測定GDSL蛋白液中的蛋白濃度。酶活與蛋白濃度的比值即為⑶SL蛋白的比活力。以C8為底物計算得到⑶SL蛋白的比活力是498U/mg。
權利要求
1.⑶SL蛋白的應用，為如下(I)或(2) (O制備脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物； 所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述(2)中，所述降解的反應條件為30-80°C>pH6. 5-8. O。
3.如權利要求I或2所述的應用，其特征在于所述(2)中，所述脂肪酶的底物為對硝基苯基乙酸酯、丁酸對硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕櫚酸酯中的至少一種。
4.如權利要求I至3中任一所述的應用，其特征在于所述GDSL蛋白為權利要求7所述方法制備得到的蛋白質。
5.將重組質粒導入大腸桿菌得到的重組菌；所述重組質粒為將GDSL蛋白的編碼基因插入載體pET_28a(+)的多克隆位點得到的重組質粒； 所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質。
6.如權利要求5所述的重組菌，其特征在于所述GDSL蛋白的編碼基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子。
7.一種制備⑶SL蛋白的方法，是培養權利要求5或6所述的重組菌，得到⑶SL蛋白；所述GDSL蛋白是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質。
8.一種降解脂肪酶的底物的方法，是采用GDSL蛋白降解脂肪酶的底物； 所述GDSL蛋白是如下(a)或(b) : (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表的序列2所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述降解的反應條件為30-80°C、pH6. 5-8. O ;所述脂肪酶的底物為對硝基苯基乙酸酯、丁酸對硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕櫚酸酯中的至少一種。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述GDSL蛋白為權利要求7所述方法制備得到的蛋白質。
全文摘要
本發明公開了GDSL蛋白在制備脂肪酶中的新用途。本發明提供了GDSL蛋白的應用，為如下(1)或(2)(1)制備脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物；所述GDSL蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列2所示氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白質。本發明發現GDSL蛋白具有脂肪酶活性，將GDSL蛋白用作脂肪酶具有如下優點可以采用較高的反應溫度；具有良好的熱穩定性；可以在堿性條件下作用；具有良好的pH穩定性；對C2-C12的底物均可發揮作用；酶活力較高。本發明為涉及脂肪酶的工藝流程開辟了一條新途徑，具有重大的經濟價值。
文檔編號C12P7/64GK102876643SQ201210356229
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者周志剛, 何夙旭, 徐俐, 楊雅麟, 張美超, 李青 申請人:中國農業科學院飼料研究所