檢測玉米褪綠斑駁病毒用引物及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測玉米褪綠斑駁病毒用引物及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]玉米褪綠斑駁病毒{Maize chlorotic mottle virus , ΜΟΜ?)是我國頒布的禁止進境的檢疫性有害生物。是一種直徑30mm二十面體，正單鏈RNA植物病毒，它屬于番前叢矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪綠斑駁病毒屬((Machlomoviru)，可通過昆蟲介體和種子傳播。該病毒的自然寄主有玉米、小麥、黍、大麥等。寄主被侵染后，癥狀表現為褪綠斑駁、壞死、矮化、穗發育差或無穗、過早死亡等癥狀。玉米褪綠斑駁病毒可引起10% -15%的產量損失，實驗的玉米損失達59%，同時可與小麥線條花葉病毒(紛eai streak mosaic virus,WSMV),甘鹿花葉病毒(azosaic κ/τ?Λ?，SvMV)或玉米矮花葉病毒(ifeize dwarfmosaic κ/τ?Λ?，MDMV)復合侵染，形成玉米致死性壞死病(maize lethal necrosis, MLN),可造成平均高達75%的產量損失，給玉米帶來毀滅性災害。
[0003]該病毒主要分布于阿根廷、墨西哥、秘魯、美國(堪薩斯州、內布拉斯加州、夏威夷)等地。目前，我國僅云南省有該病毒發生的報道。隨著玉米產業的迅速發展，種植者及加工企業對優良品種的需求越來越大，跨國種子企業試圖進入玉米等種業市場的要求越來越強烈。我國近年來玉米種子的國際貿易越來越頻繁，使其傳入的風險也越來越大，該病毒一旦發生，將導致我國的玉米經濟損失高達140億元人民幣。國內學者對該病毒的研究較少，因此相關資料及其防治經驗很少。
[0004]近年來發展的反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法因其具有靈敏、快速、特異性強等優點，在植物病毒的檢測上顯示出強大的優勢。自1990年起，國內外己相繼用RT-PCR方法檢測了多種病毒，如:馬鈴薯Y病毒(PVY)，馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)等。目前對玉米褪綠斑駁病毒基本都是基于其外殼蛋白(CP)基因的研究。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一在于提供一種檢測玉米褪綠斑駁病毒用引物。
[0006]本發明的目的之二在于提供該玉米褪綠斑駁病毒的檢測方法。
[0007]為達到上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種檢測玉米褪綠斑駁病毒用引物，其特征在于該引物為:SEQ ID N0:2和SEQ IDNO:3所示的堿基序列。
[0008]一種檢測玉米褪綠斑駁病毒的方法，采用上述的引物進行PCR擴增，其特征在于該方法的具體步驟為:提取玉米褪綠斑駁病毒以及陰性病毒的總RNA，反轉錄為cDNA，最后進行PCR擴增，檢測凝膠電泳檢測擴增產物在301bp位置是否存在單一擴增條帶，如果存在，則說明樣品中含有玉米褪綠斑駁病毒；如果不存在，則說明樣品中不含有玉米褪綠斑駁病毒。
[0009]上述的反轉錄法為:RNA模板2 μ L，RNase-Free H2O 6 μ L混合，反應溫度:65°C4min，冰上放置2min ;將5Xg DNA Buffer 2 μ L加入混合液中，反應溫度42°C 3min ;向上述 10 μ L 體系中加入 1XFast RT Buffer 2 μ L，Enzyme Mix I μ L，10 μ M 反向引物 MR0.5 μ L^PRNase-Free H2O 至 20 μ L，反應溫度 42°C 22min, 95°C 3min，_20°C保存備用；
上述的PCR擴增的體系為:50 μ L的PCR反應體系:10XPCR反應緩沖液5 μ L，dNTP為5 μ L，10 μ M上游引物和下游引物分別為I μ L，模板溶液為I μ L，TAQ酶為I μ L，最后補充ddH20 至 50 μ L ;
上述的PCR法的PCR檢測體系的具體參數為:94° C預變性2min，之后開始擴增循環，每個循環的程序為:94° C變性30s，55° C退火30s，72° C延生Imin ;循環30次后，最后72° C延生lOmin，降溫至4° C，PCR擴增結束。
[0010]登錄號為EU358605.1的Plll基因第1600-2000位核苷酸序列為SEQID NO:1所示的堿基序列，序列中下劃線部分的字母代表了引物MCMV-F和MCMV-R的位置
上游引物MCMV-F序列如SEQ ID NO: 2所示，序列特征:
長度:20bp 類型:核酸鏈型:單鏈拓撲類型:線形分子類型:DNA 最初來源:人工合成
下游引物MCMV-R序列如SEQ ID NO: 3所示，序列特征為:
長度:20bp 類型:核酸鏈型:單鏈拓撲類型:線形分子類型:DNA 最初來源:人工合成
本發明的優點和有益效果:對本發明的引物的特異性和靈敏度進行分析的結果，8株玉米褪綠斑駁病毒的陽性樣品在301bp處均擴增出特異性條帶，而陰性病毒在301bp處都未擴增出特異性條帶。證明該引物具有良好的特異性。
[0011]通過對引物靈敏度分析，該特異引物的靈敏度高，因此在樣品量較少或者病毒含量在樣品組織中含量很低的情況下，也能用該引物檢測。
[0012]本發明通過合成一對擴增玉米褪綠斑駁病毒Plll基因其中一部分序列的寡核苷酸引物，利用RT-PCR技術建立一種經濟簡便檢測玉米褪綠斑駁病毒的方法。基于對病毒的Plll基因第1600-2000位核苷酸序列分析設計的特異性反轉錄引物的檢測方法，在植物病毒檢測上具有快速、靈敏、特異性強的特點。
【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1中RT-PCR檢測方法特異性評價凝膠電泳圖；
圖2為實施例2中RT-PCR檢測方法靈敏度評價凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0014]結合具體的實施例，進一步進行闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件。所述試劑盒生物材料如無特殊說明均可從商業途徑獲得。
[0015]實施例1:
一種玉米褪綠斑駁病毒RT-PCR檢測方法，包括以下步驟:
步驟1，引物設計和合成
利用PR頂ER PRIMER5.0軟件根據玉米褪綠斑駁病毒的Plll基因第1600-2000位核苷酸序列設計I對寡核苷酸引物，上游弓I物MCMV-F和下游引物MCMV-R上游引物及其序列為:
MCMV-F (SEQ ID NO:2):5’-TGGAGCGAGTATTTTATGTG-3’
下游引物及其序列為:
MCMV-R (SEQ ID NO:3):5’-GGTACAGGATCAGCTTTCTT-3’
步驟