一種抗化膿隱秘桿菌plo蛋白單克隆抗體及其識別的抗原表位和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種單克隆抗體及其識別的抗原表位和應用，具體設及一種抗化脈隱 秘桿菌PL0蛋白（溶血素蛋白）單克隆抗體、產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發明還 設及上述單克隆抗體所識別的抗原表位多膚。本發明屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 化脈隱秘桿菌原稱化脈棒狀桿菌（Corynebacteriumpyogenes)、化脈放線菌 (Actinomycespyogenes)，1997 年定名為化脈隱秘桿菌（Arcanobacteriumpyogenes)，后更 名為hueperellapyogenes。化脈隱秘桿菌（T.pyogenes)是經濟型家畜（牛、羊、豬等）黏 膜上的一種共生菌，主要寄生于動物呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，為正常菌群的組成部 分。同時，化脈隱秘桿菌也是一種條件性致病菌，是其所在菌屬中毒力最強的細菌，可經皮 膚、黏膜破損處入侵引起臨近的組織、器官感染，也可由于吸入肺部引起肺和胸部隱秘桿菌 病，表現為肺炎、子宮內膜炎、乳腺炎、屯、內膜炎、關節炎、皮下脈腫等。溶血素（Pyolysin， 化0)蛋白由化脈隱秘桿菌（T.pyogenes)表達，是T.pyogenes分泌的唯--種溶血素，是 T.pyogenes主要毒力因子之一。1997年，Billington等從野生型菌株中克隆得到了plo基 因，獲得其全基因序列。據了解plo基因由1602個核巧酸編碼534個氨基酸（前27個氨 基酸構成信號膚），PL0蛋白成熟體分子量為57. 9kDa，共分為4個結構域值1~4)。氨基 酸序列分析表明，PL0屬于膽固醇依賴性溶細胞素煙lolesterol化enden1xytolysin，CDC) 家族成員，該家族其他成員還包括單核增生李斯特氏菌溶血素（listeriolysin，LL0)、肺 炎鏈球菌溶血素（pneumolysin，PLY)、中間鏈球菌溶血素（intermedilysin，ILY)、豬鏈球 菌溶血素（suilysin，SLY)、鏈球菌溶血素0(st;r巧tolysin0，化0)和產氣芙膜梭菌溶素 0(pe;r化ingolysin0,PF0)等，家族成員的分子結構具有很高的相似性。該家族成員可W 通過與細胞膜上膽固醇結合（ILY與人細胞膜上CD59結合），在真核細胞的細胞膜上形成穿 膜孔道，產生廣泛性的溶細胞效應。PL0能夠裂解多種動物的免疫細胞和紅細胞，將其編碼 基因（plo)敲除或將其替換為編碼無溶血活性PL0突變體的編碼基因，導致T.pyogenes毒 力的顯著降低，而且T.pyogenes感染對小鼠的致死率與PL0分泌水平呈正相關。因此，研 究PL0蛋白的功能對開發化脈隱秘桿菌防控手段具有重要價值。特異性單抗是研究蛋白質 功能的重要工具之一，本專利旨在提供一種抗化脈隱秘桿菌PL0蛋白單克隆抗體、產生該 單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并申請保護。本發明通過原核表達系統獲得重組PL0蛋白，接 著應用雜交瘤技術生產單抗，并采用基因截短技術W及Wesren-Blot方法確定特異性單抗 的抗原表位。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的之一是提供一種抗化脈隱秘桿菌PL0蛋白單克隆抗體，所述的單克 隆抗體由保藏編號為CGMCCNO. 11188的雜交瘤細胞株或保藏編號為CGMCCNO. 11189的雜 交瘤細胞株分泌產生；
[0004] 本發明的目的之二是提供產生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株； 陽〇化]本發明的目的之=是提供與所述單克隆抗體特異性結合的抗原表位多膚；
[0006] 本發明的目的之四是提供所述單克隆抗體W及與單克隆抗體特異性結合的抗原 表位多膚的用途。
[0007] 為了達到W上目的，本發明所采用的技術方案為：
[0008] 一種抗化脈隱秘桿菌PL0蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體由保 藏編號為CGMCCNO. 11188的雜交瘤細胞株分泌產生。
[0009] 一種抗化脈隱秘桿菌PL0蛋白單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體由保 藏編號為CGMCCNO. 11189雜交瘤細胞株分泌產生。
[0010] 一株抗化脈隱秘桿菌PL0蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為AP-1A3,分類 命名為抗溶血素（PL0)單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中屯、，地址在北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，菌種保藏編號 CGMCCNO. 11188,保藏日期為：2015年8月10日。
[0011] 一株抗化脈隱秘桿菌PL0蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為AP-4F12,分 類命名為抗溶血素（PL0)單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中屯、，地址在北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，菌種保藏編號 CGMCCNO. 11189,保藏日期為：2015年8月10日。
[0012] 上述雜交瘤細胞株通過W下途徑制備得到：
[0013] 將重組質粒祀T-30a(+)-plo轉化大腸桿菌，IPTG誘導下獲得可溶性表達的重組 溶血素蛋白His-PLO,對該蛋白進行純化；將純化的His-PLO蛋白作為免疫原，腹腔接種5 周齡BALB/c小鼠。按照常規雜交瘤細胞融合技術將免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞 進行融合。用純化的His-PLO蛋白為篩選抗原，建立間接化ISA方法，最終篩選出2株持續 分泌抗化脈隱秘桿菌PL0蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株AP-1A3和AP-4F12。本發明進一 步從雜交瘤細胞上清液中或從注射雜交瘤細胞的動物腹水中，獲得抗化脈隱秘桿菌PL0蛋 白的單克隆抗體。
[0014] 具體的，所述單克隆抗體由如下方法制備得到：
[0015] (1)免疫原的制備：將重組質粒祀T-30a(+)-plo轉化至E.coliRosetta〇)E3)?感 受態細胞，在IPTG誘導下，重組溶血素蛋白化S-PL0W可溶性表達的方式存在。采用Ni-NTA PurificationSystem純化重組蛋白，對收集的純化蛋白進行透析和濃縮，并W純化過的蛋 白作為抗原免疫小鼠；
[0016] 似動物免疫：用上述純化過的HiS-PL0蛋白免疫BALB/c小鼠。每只小鼠W 50yg/只的量進行頸背部皮下注射，每兩周一次共=次，第四次加強免疫一次，3天后待融 合，獲得免疫小鼠。
[0017] (3)雜交瘤細胞系的建立：取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。待 融合細胞長至孔底1/2或1/3時，通過間接ELISA篩選出陽性雜交瘤細胞株，再利用有限稀 釋法連續克隆2~3次。至陽性率為100%后進行擴大培養，凍存于液氮中。
[0018] (4)單克隆抗體的制備與純化：將篩選得到的雜交瘤細胞進行擴大培養后，腹腔 注射BLAB/C小鼠，誘生腹水。誘生的腹水用親和層析法獲得純化的單克隆抗體。
[0019] 單克隆抗體的反應特異性試驗結果表明，本發明制備的單克隆抗體是針對化脈隱 秘桿菌PL0蛋白，對化脈隱秘桿菌PL0蛋白具有反應特異性。經鑒定，單克隆抗體AP-1A3 的Ig亞類為IgGl，單克隆抗體AP-4F12的Ig亞類為IgG3。
[0020] 本發明采用基因截短技術W及Wesren-Blot方法確定上述特異性單抗的抗原表 位，AP-lA3mAb所針對的抗原表位為第64-79個氨基酸即VPVTKDQLKDGTYT V F(SEQ ID N0:1所示），編碼所述的抗原表位多膚的核巧酸序列如SEQ ID N0:2所示； AP-4F12mAb所針對的抗原表位為第58-75個氨基酸即G ESIENVPVTKDQLKD G T(SEQ ID NO:3所示），編碼所述的抗原表位多膚的核巧酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0021] 此外，本發明還提供了所述的單克隆抗體在制備檢測或診斷化脈隱秘桿菌PL0蛋 白試劑或藥物中的應用。W及所述的抗原表位多膚在制備檢測抗化脈隱秘桿菌PL0蛋白的 抗體試劑中的應用。
[0022] 綜上所述，本發明提供一種抗化脈隱秘桿菌PL0蛋白單克隆抗體及產生該單克隆 抗體的雜交瘤細胞株，本發明還提供了與所述單克隆抗體特異性結合PL0蛋白的抗原表位 多膚。本發明的技術方案對PL0生物活性的研究及相關疫苗和治療手段的開發具有重要意 義。
【附圖說明】
[0023] 圖1為AP-lA3mAb(單克隆抗體）反應性及針對抗原表位的WesternBlot鑒定結 果圖；
[0024] 圖2為AP-4F12mAb(單克隆