微流體多孔型細胞培養測試裝置的制造方法
【技術領域】
[0001 ] 本公開內容大體上涉及微流體多孔型細胞培養測試裝置。
【背景技術】
[0002]通常，通過下述步驟觀察細胞對藥物的響應:將細胞放入多孔板、注入液體形式的藥物并使用光學測定系統監視細胞的時間依賴性變化以獲得統計結果。Kirby-Bauer (KB)測試是已知的固體介質中的抗生素易感性測試方法，其中細菌散布在瓊脂培養基上，在其上放置吸附有抗生素的紙，并觀察細菌生長。在液體培養基中微稀釋測試的情況下，已經開發了許多自動化系統，例如VITEK2、Microscan和Phoenix，以用于抗生素易感性測試。此類系統可通過下述過程用于抗生素易感性測試:將抗生素放在微米尺寸的孔中，向孔中與液體培養基一起注射細菌，通過濁度統計學上監視并確定細菌生長。
[0003]當使用常規系統測試細胞對不同藥物的響應時，將細胞放入液體或固體培養基中，將藥物與液體培養基混合，或者將吸附有藥物的紙盤放置在固體培養基上以使細胞對藥物響應，通過濁度(吸光度)測定而確定細胞生長對藥物的響應。但是，此類方式依賴于統計學有效數據的采集而不是依賴于單個細胞的變化，需要長時間溫育(通常16?24小時)，因為需要使至少預定數量的細胞(通常約1，000, 000個細胞/ml)生長以獲得統計學結果。在該情況下，不可能監視存在的單個細胞針對藥物的變化以及實時監視運動的單個細胞。此外，需要大量時間和勞動來測試大量的藥物，因為各個藥物是分別注射的。用于在固體培養基中抗生素易感性測試的KB測試基本上要求大量的瓊脂培養基板來測試數十種抗生素的易感性，這是因可以放置在固體培養基上的藥物的數量受限導致的。VITEK是一種開發用于最小化測試時間的自動化系統，也要求約12小時的相對長時間，因為細菌濁度要增加至預定水平。此外，由于用于常規測試方法的環境不同于體內環境，測試結果和體內出現的現象之間可能存在很多實質性差異(Gregory G.Anderson等，(2003), “Intracellular Bacterial B1fiIm-Like Pods in Urinary TractInfect1ns”, Science 301，105 ;Gallo 等，(2011)，“Demonstrat1n of Bacillus cereusin Orthopaedic-1mplant-Related Infect1n with Use of a Mult1-Primer PolymeraseChain React1n-Mass Spectrometric Assay.，，，J Bone Joint Surg Am, 93)。
[0004]因此，需要開發一種用于抗生素易感性測試的相對于常規技術精確且快速的技術。
【發明內容】
[0005]本發明的一個方面提供一種微流體多孔型細胞培養測試裝置，其具有多個對齊的微流體孔單元的陣列結構，每個微流體孔單元包含第一流體穿過其進入的入口、適于在其中收容第二流體的收容室、第一流體流動經過其中的微流體通道和適于促進第一流體的進入的空氣出口，其中所述微流體通道與所述入口和所述空氣出口連通從而使所述第一流體能流入并填充所述微流體通道，其中所述收容室設計為孔的形式以便保持進入的第二流體，并且在其中所述收容室的下方側面部與所述微流體通道的側面部連通之處形成毛細管閥，從而使所述第一流體和所述第二流體彼此相遇而形成界面。
[0006]根據一個實施方式，所述微流體孔單元的尺寸與市售多孔板的各個孔的尺寸一致。
[0007]根據一個實施方式，各個孔布置成1X1、1X2、1X4、2X4、4X6、12X8、24X16或48X32的矩陣。
[0008]根據一個實施方式，所述微流體通道布置成圍繞所述收容室以使所述微流體孔單元具有四邊形結構。
[0009]根據一個實施方式，所述毛細管閥具有預定厚度和寬度以防止所述第一流體進入所述收容室。
[0010]本發明的另一方面提供一種使用微流體多孔型細胞培養測試裝置的細胞分析方法，所述微流體多孔型細胞培養測試裝置具有多個對齊的微流體孔單元的陣列結構。每個微流體孔單元包含讓含膠凝劑液體介質和生物試劑的混合溶液穿過其進入的入口、適于在其中收容生理活性物質的收容室、與所述入口連通并且所述液體介質流動經過其中的微流體通道以及所述微流體通道的下方側面部通過其與所述收容室的側面部連通的毛細管閥。所述細胞分析方法包括下述步驟:(a)向所述入口引入所述含膠凝劑液體介質和所述生物試劑的混合溶液，以在微流體通道中填充所述混合溶液，并使所述混合溶液膠凝而形成固體薄膜；(b)將所述生理活性物質供應至所述收容室中，并使所述生理活性物質通過所述毛細管閥擴散至所述固體薄膜中；和(C)在單個細胞基礎上，觀察在所述混合溶液和所述生理活性物質彼此相遇的界面處發生的生物試劑的變化。
[0011]根據一個實施方式，步驟(a)可以包括:(a_l)將含有所述生物試劑的溶液引入所述入口以填充所述微流體通道的一部分，和(a-2)進一步將所述含膠凝劑液體介質引入所述入口以使所述液體介質形成層流并且填充所述微流體通道，從而在所述微流體通道的上壁表面和下壁表面上形成所述生物試劑的單層。
[0012]根據一個實施方式，所述細胞分析方法還包括步驟(d):在單個細胞基礎上觀察所述生物試劑對所述生理活性物質的響應，以確定所述生理活性物質的最小抑制濃度(MIC)或最小生物膜清除濃度(MBEC)。
【附圖說明】
[0013]圖1和2說明本發明的一個實施方式的微流體多孔型細胞培養測試裝置。
[0014]圖3是微流體孔單元的截面圖。
[0015]圖4是顯示使用具有96孔芯片設計的細胞培養測試裝置的成像步驟的示意圖。
[0016]圖5顯示使用根據本發明的一個實施方式的細胞培養測試裝置來進行抗生素易感性測試的步驟。
[0017]圖6顯示證明青霉素抗生素針對糞腸球菌(E.faecalis)菌株的MIC值可以使用MAC芯片快速地確定的試驗結果的圖像。
[0018]圖7顯示示出響應于抗生素的生物膜的形狀的圖像，其使用根據本發明的一個實施方式的MAC芯片進行研究。
[0019]圖8顯示在瓊脂糖與革蘭氏陰性細菌的溶液混合的狀態下，在不同濃度的β -內酰胺抗生素的存在下革蘭氏陰性細菌物種在瓊脂糖中的生長。
[0020]圖9是解釋圖8中所示現象的詳解圖。
[0021]圖10顯示在內酰胺抗生素的存在下在大腸桿菌(E.coli)菌株中圖9所解釋的現象的發生。
[0022]圖11顯示將原料引入微流體通道中以獲得細菌單層的圖像的步驟。
[0023]圖12顯示示出在細菌形成單層的狀態下在不同濃度的抗生素的存在下細菌物種的生長的圖像。
[0024]圖13顯示示出在小于MIC和大于MIC的不同濃度的作為內酰胺抗生素的氨曲南(aztreonam)的存在下銅綠色假單胞菌(P.aeruginosa)菌株的生長的圖像。
[0025]圖14和15是顯示不使用抗生素時的兩種細菌菌株和對抗生素具有抗性的兩種細菌菌株的生長的光學顯微鏡圖像，揭示了可以測定所述細菌菌株的雙重感染。
[0026]圖16是顯示使用根據本發明的一個實施方式的細胞培養測試裝置對哺乳動物細胞進行3D培養的圖。
[0027]圖17顯示使用MAC芯片通過單個細胞形態分析(SCMA)測定的4種臨床菌株物種的MIC值。
【具體實施方式】
[0028]以下將參照附圖詳細描述本發明的實施方式。但是，本發明不限于本文提出的實施方式并且可以以許多不同形式體現。相反，提供這些實施例是為了使本文充分完整，并且全面傳遞本發明的范圍。在附圖中，為了清晰可能會放大要素的尺寸，例如寬度和厚度。完全從觀察者的角度解釋附圖。會理解的是，當提到要素“在另一要素上”時，其可以直接在其他要素上，或者其間還可以存在一個或多個中間要素。本領域技術人員會意識到可以進行許多改進和變化而無需背離本發明的主旨。整個附圖中，使用相同的附圖標記來實質上指定相同的要素。
[0029]另一方面，本文所用術語應該如下理解。術語“第一”、“第二”等僅用于將一個要素