成人干細胞的體外擴增的制作方法
【專利說明】成人干細胞的體外擴增 相關申請的交叉引用
[0001] 本申請要求2013年3月11日提交的美國臨時申請No. 61/776, 422和2013年3 月12日提交的美國發明申請No. 13/795, 659的權益和優先權，將該臨時申請和發明申請以 引用方式整體并入本文。 政府利益
[0002] 本發明是在美國國立衛生研究院（National Institute of Health)授予的編號 為5R44HL091740-03的政府資助下作出的。政府在本發明中具有某些權利。 序列表、表格或計筧機稈序表的引用
[0003] 本申請隨電子格式的序列表一起提交。該序列表作為2014年3月10日創建的標 題為"106417-0182_5叫_1^5^.丨#"的文件提供，大小為101?字節。電子格式的該序列表 中的信息以引用方式整體并入本文。
技術領域
[0004] 本文提供涉及長期干細胞、產生這類細胞的方法以及各種蛋白質構建體的實施 例。
【背景技術】
[0005] 長期造血干細胞（LT-HSC)是存在于成人骨髓中并產生全部成熟紅細胞組庫的稀 有祖細胞。這些細胞對于所有紅細胞區室的維持是必要的。在針對惡性血液病、自身免疫 性和免疫缺陷等的療法中，干細胞移植可以是一種有用的輔助療法。
【發明內容】
[0006] 在一些實施例中，提供一種產生條件性無限增殖化成人干細胞群體的方法。該方 法可包括向一種或多種成人干細胞提供外源合成的能促進細胞存活或增殖中的一者或多 者的Myc多肽和外源合成的能抑制凋亡的Bcl-2結構域多肽。在一些實施例中，該Myc多 肽以至少約72小時的時間間隔提供給該一種或多種成人干細胞并且該Bcl-2結構域多肽 以至少約96小時的時間間隔提供給該一種或多種成人干細胞，以產生條件性無限增殖化 成人干細胞群體。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不 超過每小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不 超過每兩小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率 不超過每三小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻 率不超過每四小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的 頻率不超過每五小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽 的頻率不超過每六小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多 肽的頻率不超過每七小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc 多肽的頻率不超過每八小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc 多肽的頻率不超過每九小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc 多肽的頻率不超過每十小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc 多肽的頻率不超過每^^一小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該 Myc多肽的頻率不超過每十二小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或 該Myc多肽的頻率不超過每十三小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/ 或該Myc多肽的頻率不超過每十四小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽 和/或該Myc多肽的頻率不超過每十五小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域 多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每十六小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結 構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每十七小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2 結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每十八小時一次。在一些實施例中，供應該 Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每十九小時一次。在一些實施例中，供應 該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二十小時一次。在一些實施例中， 供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二^^一小時一次。在一些實施 例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二十二小時一次。在一 些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二十三小時一次。 在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每二十四小時 一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每三十六 小時一次。在一些實施例中，供應該Bcl-2結構域多肽和/或該Myc多肽的頻率不超過每 四十八小時一次。
[0007] 在一些實施例中，提供Myc融合蛋白。該融合蛋白包含蛋白轉導結構域、能促進細 胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽、V5結構域和六組氨酸表位標簽。
[0008] 在一些實施例中，提供干細胞擴增培養基。該擴增培養基包含IL3、IL6、干細胞因 子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。
[0009] 在一些實施例中，提供Myc融合蛋白。該Myc融合蛋白包含蛋白轉導結構域、能促 進細胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽。該Myc融合蛋白的半壽期超過約60分鐘。
[0010] 在一些實施例中，提供編碼本文公開的任何蛋白質的核酸。
[0011] 在一些實施例中，提供包含本文提供的任何核酸的載體。
[0012] 在一些實施例中，提供包含本文提供的任何載體或核酸的細胞。
【附圖說明】
[0013] 各個實施例的特征在所附的權利要求書中以具體特征闡述。通過參考下文的"具 體實施方式"和附圖，將獲得對本發明一些實施例的特征和優點的更好的理解，在"具體實 施方式"中闡述利用各個實施例的原理的示例性實施例，而在附圖中：
[0014] 圖1A、1B、1C、ID和IE顯示Tat融合蛋白的產生和體外表征的示例性實施例。圖 IA顯示Tat-Myc融合蛋白和Tat-Bcl-2融合蛋白的示意圖的示例性實施例，包括HIV-ITat 的框內蛋白轉導結構域及V5和6xHis標簽的位置。圖IB顯示從大腸桿菌（E. coli)純化、 經SDS-PAGE分離并用考馬斯染色后的重組蛋白的示例性實施例。圖IC顯示暴露于純化 的重組Tat-Myc、Tat-Bcl-2或保持未處理（NT)達兩小時，然后用抗V5的單克隆抗體并用 Hoechst 9934核染劑固定和染色的匯合3T3細胞的菌苔的示例性實施例。Tat-Myc蛋白 在這個時間范圍主要定位于核區域，而Tat-Bcl-2保持在細胞質和核周空間。圖ID顯示 經如下處理的源自人臍帶血的HSC的SDS-PAGE和蛋白質印跡分析（抗V5和β -肌動蛋白 的單克隆抗體）：利用Tat-Myc的單次暴露來沖擊致敏1小時，洗滌，然后裂解（在指定的 時間點）以將質膜和細胞質級分與核級分分離。圖IE顯示經如下處理的源自人臍帶血的 HSC的核級分的SDS-PAGE和蛋白質印跡分析（抗V5和β-肌動蛋白的單克隆抗體）：利用 Tat-Myc的單次暴露來沖擊致敏2小時，洗滌，然后裂解（在指定的時間點）以將質膜和細 胞質級分與核級分分離。該蛋白質的大部分在24小時至48小時之間失去。在72小時后 的任何時間點沒有剩余可檢測的蛋白質。
[0015] 圖2A、2B、2C和2D顯示表明重組Tat-Myc和Tat-Bcl-2具有生物活性的示意圖的 示例性實施例。圖2A和2B顯示在單獨培養基（無處理，NT)、補加有Tat-Cre (Tat對照， TC)或遞增濃度的Tat-Myc(TM)(圖2A)或Tat-Bcl-2 (TB)(圖2B)的培養基中再次平板接 種48小時的體外活化T細胞的示意圖的示例性實施例。還顯示了起始細胞群體中的活細胞 的頻率（淺灰色柱條）。圖2C和2D顯示進一步用Tat-Myc溫育并用CFSE標記的活化T細 胞的示意圖的示例性實施例，表明該活化T細胞保持母細胞化表型（blasting phenotype) (圖2C)并且去除抗原刺激和外源添加的細胞因子后繼續增殖（圖2D)。
[0016] 圖3A、3B和3C顯示鼠 HSC在體外用Tat-Myc和Tat-Bcl-2擴增的示意圖的示例 性實施例。圖3A顯示具有c-Kit+、Sca-I+表型并且呈現譜系標志物（Mac-1、Gr-1、B220、 ⑶3、Ter-119和Flk-2)陰性的所得細胞群體的FACS分析的坐標圖的示例性實施例。圖3B 顯示與在沒有添加 Tat融合蛋白的培養物中的HSC (淺灰色，最右邊的跡線）相比，HSC在 體外用Tat-Myc和Tat-Bcl-2進行培養時的增殖（深灰色，最左邊的跡線）的示意圖的示 例性實施例。圖3C顯示在具有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的培養物中體外細胞擴增的動力學 的示意圖的示例性實施例。
[0017] 圖4A、4B、4C和4D顯示用Tat-Myc和Tat-Bcl-2擴增的鼠 Ptlt-HSC在體內的功 能分析的示意圖的示例性實施例。幾群經亞致死性輻照的Rag-I /小鼠被給予10 3個源自 從野生型C57BL/6J小鼠獲得的骨髓細胞的ptlt-HSC。圖4A顯示與Rag-I /對照（第一小 圖）相比，來自Ptlt-HSC嵌合小鼠（第二小圖）的外周血中成熟B細胞的存在的FACS分 析（⑶19/B220表達）的示意圖的示例性實施例。圖4B顯示與Rag-I /對照（第一小圖） 相比，Rag-1 / ptlt-HSC嵌合小鼠（第二小圖）的外周血中成熟T細胞的存在的FACS分析 (TCR β /⑶4表達）的示意圖的示例性實施例。圖4C顯示來自Rag-1 / ptlt-HSC嵌合小鼠的 淋巴器官（脾臟、胸腺、淋巴結和骨髓）中的發育中的T細胞和B細胞的FACS分析（CD19/ IgM和CD8/CD4表達）的示意圖的示例性實施例。圖4D示出的數據證明成熟淋巴樣細胞在 經它們的抗原受體活化后能夠母細胞化并進行細胞分裂。
[0018] 圖5A、5B、5C、ro和5Ε顯示用Tat-Myc和Tat-Bcl-2擴增源自人臍帶血細胞的HSC 的示意圖的示例性實施例。圖5A顯示在體外擴增14天的人臍帶血細胞的表面表型的FACS 分析的不意圖的不例性實施例（頂部各小圖僅用細胞因子混合物；底部各小圖用補加有 Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細胞因子混合物）。圖5B顯示在兩組條件下⑶34+細胞的體外擴 增的動力學的示意圖的示例性實施例。圖5C顯示源自人ptlt-HSC的、在甲基纖維素測定 法中在支持髓類紅細胞分化的條件下發育的三種不同集落類型的圖像的示例性實施例。圖 顯示在接種了 IO3個用細胞因子混合物培養的臍帶血細胞（FCB)UO 3個用補加 Tat-Myc 和Tat-Bcl-2的細胞因子混合物培養的臍帶血細胞（FCB+TMTB)或IO4個新鮮的未經操縱 的臍帶血細胞（ΚΓ4新鮮FCB)的甲基纖維素培養物中觀察到的每種集落類型的定量的示 意圖的示例性實施例。圖5E顯示再次平板接種圖f5D中所示的細胞時在甲基纖維素培養物 中觀察到的集落數目的定量的示意圖的示例性實施例。
[0019] 圖6A、6B、6C、6D、6E、6F和6G顯示源自人臍帶血的蛋白轉導長期（ptlt)-HSC的 體內功能分析的示意圖的示例性實施例。圖6A顯示幾群被給予如下移植物的經亞致死性 輻照的NSG小鼠的骨髓的FACS分析的示意圖的示例性實施例：106個在細胞因子混合物中 體外擴增的臍帶血細胞（第一小圖；FCB)，或IO6個在補加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細胞 因子混合物中擴增的臍帶血細胞（第二小圖；FCB TMTB)，或5X IO6個新鮮的未經操縱的 臍帶血細胞（第三小圖；新鮮FCB)。圖6B顯示來自異種嵌合小鼠的骨髓、脾臟和胸腺細胞 的FACS分析的示意圖的示例性實施例。對所有細胞的人CD45進行染色。對CD45+細胞設 門，顯示出骨髓中的人CD34+CD38lci細胞（第一小圖；骨髓）；脾臟中的人CD19+和人CD3+ 淋巴細胞（第二小圖；脾臟）；和胸腺中的人CD3+細胞（第三小圖；胸腺）。圖6C顯示用 CFSE標記并在抗人CD40和IgM的單克隆抗體存在下培養的人脾臟B細胞的FACS分析的 示意圖的示例性實施例。在NSG異種嵌合小鼠中發育的人B細胞在它們的抗原受體刺激后 發生增殖。圖6D顯示來自從NSG異種嵌合小鼠的骨髓獲得并在甲基纖維素上平板接種的 人CD34+CD38lci細胞的髓類紅細胞集落的定量的示意圖的示例性實施例。圖6E顯示再次平 板接種后髓類紅細胞集落的發育的定量的示意圖的示例性實施例。圖6F顯示在細胞因子 混合物（空心圓圈）或補加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細胞因子混合物（黑色正方形）中 體外擴增的CD45陽性骨髓細胞群體中的髓樣細胞和淋巴樣細胞分化（CD 11b、CD33、CD3和 ⑶19表達）的定量的示意圖的示例性實施例。圖6G顯示在細胞因子混合物（空心圓圈） 或補加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細胞因子混合物（黑色正方形）中體外擴增的⑶45陽 性脾臟細胞群體中的髓樣細胞和淋巴樣細胞分化（⑶11b、⑶33、⑶3和⑶19表達）的定量 的示意圖的示例性實施例。
[0020] 圖 7A、7B、7C、7D、7E、7F 和 7G 顯示用 Tat-Myc 和 Tat-Bcl-2 體外擴增成人 G-CSF 動 員的HSC的示意圖的示例性實施例。圖7A顯示人CD45+細胞的表面表型的示意圖的示例性 實施例，表明了人⑶34+級分和⑶38+級分的富集。圖7B顯示在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存 在下在培養物中進行體外細胞擴增18天時間的動力學的示意圖的示例性實施例。圖7C顯 示表明了 5X103個用Tat-Myc和Tat-Bcl-2在體外擴增的成人G-CSF HSC在甲基纖維素中 產生4種形態學上不同的集落類型的示意圖的示例性實施例。圖7D顯示表明了用Tat-Myc 和Tat-Bcl-2在體外擴增的成人G-CSF HSC在異種嵌合NSG小鼠中產生人造血譜系的FACS 分析的示意圖的示例性實施例。骨髓來自移植了用補加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細胞因 子混合物（第一小圖；G-CSF+TMTB)或用新鮮的未經操縱的臍帶血細胞（第二小圖；新鮮 FCB)擴增的ptlt-HSC的NSG小鼠。圖7E顯示來自骨髓、脾臟和胸腺的細胞的FACS分析 的示意圖的示例性實施例。骨髓細胞包括人CD45細胞（它們也是人CD34+和CD38+)(第 一小圖）、脾臟細胞包括人CD45細胞（也對它們的人CD3進行染色）（第二小圖）；胸腺細 胞包括人⑶45細胞及⑶3 (第三小圖）。圖7F和7G顯示對植入了 IO6個在補加 Tat-Myc 和Tat-Bcl-2的細胞因子混合物中（黑色正方形）體外擴增的G-CSF動員細胞的一群異種 嵌合小鼠進行髓樣細胞和淋巴樣細胞分化評估的示意圖的示例性實施例。對骨髓細胞（圖 7F)和脾臟細胞（圖7G)的⑶45陽性群體分析⑶11b、⑶33、⑶3和⑶19表達。
[0021] 圖8顯示用CFSE標記并分別在抗小鼠⑶3或⑶40和IgM的單克隆抗體存在下培 養的小鼠脾臟T細胞和B細胞的FACS分析的示意圖示例性實施例。在移植了來自5FU處 理的C57BL. 6的擴增HSC的Ragl-/-小鼠中發育的小鼠 T細胞（第一小圖，最左邊的淺灰 色線條）和B細胞（第二小圖，最左邊的淺灰色線條）與未經刺激的細胞（最右邊的深灰 色線條）相比，在它們的抗原受體刺激后發生增殖。
[0022] 圖9A和9B顯示各種Myc融合蛋白構建體在活化T細胞活力測定中的活性的示例 性實施例。圖9A顯示一些代表性的Myc融合蛋白構建體的示例性概略性比對。圖9B顯示 在用代表性的Myc融合蛋白構建體處理后48小時活T細胞百分數的示意圖的示例性實施 例。
[0023] 圖10A、10B、IOC和IOD顯示各種Tat融合蛋白（各為50 μ g/ml)在活化T細胞活 力測定中的活性的示例性實施例。圖IOA顯示來自未經處理的細胞（無處理）的FACS分 析（前向和側向散射）的活門（live gate)的示意圖的示例性實施例。圖IOB顯示來自經 Tat-Cre處理的細胞（Tat-Cre對照）的FACS分析（前向和側向散射）的活門的示意圖的 示例性實施例。圖IOC顯示來自經Tat-Bcl2處理的細胞（Tat-Bcl2)的FACS分析（前向 和側向散射）的活門的示意圖的示例性實施例。圖IOA顯示來自經Tat-Myc處理的細胞 (Tat-Myc)的FACS分析（前向和側向散射）的活門的示意圖的示例性實施例。
[0024] 圖11顯示在多種細胞因子存在下并且在有或沒有PTD融合蛋白的情況下擴增的 CD34+細胞的數目的示意圖的示例性實施例。
[0025] 圖12顯示來自接受了 5ΧΚΓ6個在單獨FCB培養基（頂部小圖）或補加有 Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培養基（左下小圖）中擴增的細胞的NSG小鼠的、對人⑶45染 色的骨髓細胞的FACS分析的示意圖的示例性實施例。注意在接受了用Tat-Myc和Tat-Bcl2 處理的細胞的小鼠中人CD45+細胞的增加。CD45+細胞進一步通過流式細胞術進行分析以 確定CD34陽性細胞的存在（右下小圖）。
[0026] 圖13顯示來自接受了 5ΧΚΓ6個在單獨FCB培養基（頂部小圖）或補加有 Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培養基（左下小圖）中擴增的細胞的NSG小鼠的、對人⑶45染 色的脾臟細胞的FACS分析的示意圖的示例性實施例。注意在接受了用Tat-Myc和Tat-Bcl2 處理的細胞的小鼠中人CD45+細胞的增加。CD45+細胞進一步通過流式細胞術進行分析以 確定CD19和CD3陽性細胞的存在（右下小圖）。
[0027] 圖14顯示來自接受了 5ΧΚΓ6個在單獨FCB培養基（頂部小圖）或補加有 Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培養基（左下小圖）中擴增的