一種用于激活黑色素瘤特異性免疫反應的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種增強抗癌免疫的試劑盒，尤其設及一種用于激活黑色素瘤特異性 免疫反應的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 黑色素瘤是由異常黑素細胞過度增生引發的常見的皮膚腫瘤，惡性程度極高，占 皮膚腫瘤死亡病例的極大部分，多發生于皮膚或接近皮膚的黏膜，也見于軟腦膜和脈絡膜， 其發病率隨人種、地域、種族的不同而存有所差異，但近年來發病率卻呈不斷上升趨勢，每 年美國有25000個惡性黑素瘤新增病例，死亡約6000人，發病率在急速上升。
[0003] 自進入二十一世紀W來，分子生物學與免疫學的長足進步為臨床腫瘤治療提供了 新的策略。通過分子生物學的手段已鑒定出大量的腫瘤細胞特異性的抗原，并通過生物信 息學的手段分析出其被免疫細胞識別的位點，運為重建患者的腫瘤特異性免疫反應帶來的 可能。但是最近十年W來的一系列臨床試驗結果顯示，W腫瘤特異性抗原膚為基礎的腫瘤 疫苗的臨床效果令人失望，其中一個重要的原因是抗原提呈過程的缺陷。
[0004] XiZhao等人用慢病毒感染的DC細胞使其持續性高表達外源性IL12,發現 DC.IL12細胞能夠高效的誘導抗原特異性CTL細胞的產生，將DC.IL12與腫瘤抗原膚回輸至 小鼠體內可顯著性的縮小腫瘤腫塊。感染空載病毒的DC細胞并不能有效的激發相應的免 疫反應，回輸后對小鼠的腫瘤大小無顯著性的影響。該研究提示了高表達IL12的DC細胞 對于腫瘤疫苗發揮其抗癌臨床作用的重要性。 陽0化]DC細胞是哺乳類動物體內具有抗原提呈能力的一類細胞，其主要功能是攝取、加 工處理和遞呈抗原，激活或調節適應性免疫應答。T細胞因此被激活而生成MHC-I類限制性 CD8陽性細胞毒性T細胞（切totoxicTIympho巧te，CTL)和MHC-II類限制性的CD4陽性的 一型T輔助細胞（typelThelper,Thl)。一型極化樹突狀細胞（Typel化IarizedDen^itic cell,DC1)是成熟DC細胞的一類亞群，具有強有力的免疫激活能力。DCl細胞的重要的特 征是高表達IL12P70W及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特異性的CD8+T細胞和 CD4+Thl細胞相關的免疫反應。Ro化ieB.Mailliard等證實了DCl體外誘導黑色素瘤抗原 特異性的CTL細胞的能力可達到正常的成熟DC細胞的40倍W上。A化ianaTLarregina 等人還發現DCl細胞誘導B16黑色素瘤抗原特異性CD4+輔助性T細胞，并且促進CD4+輔 助性T細胞對腫瘤組織的浸潤。因此，高表達IL12的DCl細胞負載腫瘤特異性抗原膚可W 為增強抗原膚為基礎的腫瘤治療療效提供了一種策略，但現有技術中還沒有能夠相應的、 成熟的并適用于激活腫瘤特異性免疫反應的試劑盒。
【發明內容】
[0006] 本發明為解決現有技術中的上述問題提出一種試劑盒用于黑色素瘤的臨床治療。 體外誘導腫瘤患者自體的DC細胞，獲得富集DCl細胞的產物；DCl細胞負載腫瘤特異性膚 段組合，可W用于體外或體內的腫瘤抗原特異性的細胞毒性T細胞的誘導。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明所提供的技術措施為：
[0008] 本發明提供了一種用于激活黑色素瘤特異性免疫反應的試劑盒，包括有 RPMI-1640培養基、細胞培養上清、GM-CSF、IL-4、INF丫W及黑色素瘤特異性抗原多膚 組合；其中，所述細胞培養上清為NK細胞與K562細胞共培養上清或者T細胞培養上清； 所述黑色素瘤特異性抗原多膚組合為MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、GP100-A2、 GP100-A3、MART-1-A2W及TRP-2-A2,其多膚序列分別如沈QIDNo. 1，沈QIDNo. 2,沈Q IDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQIDNo. 5,SEQIDNo. 6 及沈QIDNo. 7 所示。
[0009] 為了進一步優化上述技術方案，本發明所采取的技術措施還包括：
[0010] 優選地，NK細胞與K562細胞共培養上清通過將K562細胞與NK細胞按1:2至1:10 比例共培養并加入IFNa，24小時后收集培養基上清而獲得。
[0011] 優選地，所述T細胞培養上清的制備過程中，首先分離外周血單核細胞，淋己細胞 分離液分理單個核細胞，用CD8磁珠分選出CD8巧細胞后，接種至培養基中，CD3CD28Beads， 24h后加入等量培養基，4化后收集T細胞培養上清。
[0012] 優選地，利用試劑盒激活黑色素瘤病人腫瘤特異性免疫反應包括W下步驟：
[0013] 步驟一，分離病人外周血中的單核細胞，細胞短暫貼壁培養之后，移除懸浮細胞， 加入誘導劑GM-CSF和IL-4培養兩天，培養第3天，第5天更換一半量的培養基，并加入黑 色素瘤特異性抗原多膚組合，獲得負載有黑色素瘤特異性抗原多膚組合的成熟DC細胞；
[0014] 步驟二，將所述步驟一中制得的成熟DC細胞用INF丫W及所述的NK細胞與K562 細胞共培養上清進一步培養誘導兩天，使所述的成熟DC細胞分化為DCl細胞；
[0015] 步驟=，利用步驟二所獲得的DCl細胞進行體內主動誘導和/或體外被動誘導。
[0016] 優選地，所述NK細胞來源于人類廝帶血。
[0017] 優選地，所述T細胞培養上清為利用自體或異體T細胞獲得。
[0018] 優選地，所述步驟=中的體內主動誘導過程為將所述步驟二所獲得的DCl細胞回 輸到病人體內。
[0019] 優選地，所述步驟=中的體外被動誘導過程為將所述步驟二所獲得的DCl細胞與 T細胞混合培養，并再次負載黑色素瘤特異性抗原多膚，然后收集細胞，回輸到病人體內。
[0020] 優選地，試劑盒還可W包括GG巧51培養基、DMEM/F12培養基或DMEM培養基。
[0021] 本發明采用上述技術方案，與現有技術相比，本發明的技術效果體現在W下幾個 方面：
[0022] 首先，本發明提供了一組用于黑色素瘤免疫治療的特異性抗原多膚組合，該組合 包含了多種黑色素腫瘤細胞的特異性表達抗原的膚段。運些膚段包括了HLA-A2與A3呈遞 的序列區域，覆蓋了 80%W上的已報道的黑色素瘤細胞特異性抗原。因此，我們提供了一種 新的黑色素瘤特異性抗原多膚組合，有利于激活罹患黑色素腫瘤病人的針對腫瘤細胞的獲 得性免疫反應。
[0023] 其次，本發明還提供了一種利用本發明的試劑盒，體外制備成熟DCl細胞，用于負 載黑色素瘤細胞特異性抗原組合的方法。與常用誘導方案相比，利用本發明試劑盒所制備 的產物中擁有成熟表型的DC細胞含量顯著性提高（如CD80,CD86,CD4化等表面抗原高表 達）；經過SCD4化刺激之后，DCl細胞IL12P70表達量大大高于通用方案制備細胞的表達 量。由此可見，本發明提供了一個更有效成熟DCl細胞制備方案，所得細胞產物可W用于黑 色素瘤細胞特異性抗原負載。
[0024] 最后，本發明提供了一種用于腫瘤治療的DCl負載抗原膚的臨床應用方案。DCl細 胞負載腫瘤特異性抗原之后，一部分細胞回輸至患者體內，另一部分用于體外腫瘤抗原特 異性的誘導細胞毒性T細胞（CTL)，通過體內/體外，主動誘導/被動誘導相結合的方式激 活腫瘤特異性的免疫反應。
【附圖說明】 陽0巧]圖1為利用本發明的試劑盒（細胞培養上清為NK細胞與K562細胞共培養上清） 制備的DCl細胞與常規方案制備的成熟DC細胞相比，CCR7,CD70,HLA-DR，CD83,CD86等DC 細胞與免疫激活相關的標志物表達量情況；
[0026] 圖2為本發明的試劑盒（細胞培養上清為T細胞培養上清）制備的DCl細胞（10% 和40%比例的T細胞培養上清）與常規方案制備的對照DC細胞相比，CDl1C，CD70,HLA-DR， CD83,CD86等DC細胞與免疫激活相關的標志物表達量情況；
[0027] 圖3為經過SCD40L激活之后，本發明試劑盒（細胞培養上清為NK細胞與K562細 胞共培養上清）制備的DCl細胞所分泌的IL-12與常規方案制備的成熟DC細胞分泌量之 對比；
[0028] 圖4為經過SCD4化激活之后，本發明試劑盒（細胞培養上清為T細胞培養上清） 制備的DCl細胞（10%和40%比例的T細胞培養上清）所分泌的IL-12與常規方案制備的 成熟DC細胞分泌量之對比；
[0029] 圖5為本發明試劑盒（細胞培養上清為NK細胞與K562細胞共培養上清）制備的 DCl細胞誘導T細胞之后，ELIspot試驗中IFN丫分泌水平與常見方案制備的DC細胞誘導 之對比；
[0030] 圖6為本發明試劑盒（細胞培養上清為T細胞培養上清）制備的DCl細胞（10% 和40%比例的T細胞上清）誘導T細胞之后，ELIspot試驗中IFN丫分泌水平與常見方案 制備的DC細胞誘導之對比。
【具體實施方式】
[0031] 本發明提供了一種用于激活黑色素瘤特異性免疫反應的試劑盒，包括有 RPMI-1640培養基、細胞培養上清、GM-CSF、IL-4、INF丫W及黑色素瘤特異性抗原多膚 組合；其中，所述細胞培養上清為NK細胞與K562細胞共培養上清或者T細胞培養上清； 所述黑色素瘤特異性抗原多膚組合為MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、GP100-A2、 GP100-A3、MART-1-A2W及TRP-2-A2,其多膚序列分別如沈QIDNo. 1，沈QIDNo. 2,沈Q IDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQIDNo. 5,SEQIDNo. 6 及沈QIDNo. 7 所示。
[0032] 下面通過具體實施例對本發明進行詳細和具體的介紹，W使更好的理解本發明， 但是下述實施例并不限制本發明范圍。
[0033] 實施例一（細胞培養上清為T細胞培養上清）
[0034] 在利用本發明的試劑盒激活黑色素瘤病人特異性免疫反應時，首先進行成人外周 血來源的一型極化樹突狀細胞的制備（typeIpolarizedden化iticcell,DC1)。外周血 單個核細胞分離參照根據化nuleit等（GeneTher. 200310(3))所述的方法。首先用通過 Ficoll-Hypaque密度梯度離屯、分離外周血單個核細胞，并收集血漿用于后續的培養。按密 度3.OXlOVml，將細胞接種至T75培養瓶中，并在GG巧51培養基中加入10 %血漿，置于 37. (TC、飽和濕度、5%C〇2環境中培養。培養化后，洗去懸浮的淋己細胞，加入含GM-CSF和 IL-4 1000IU/mlW及10%血漿的DMEM/F12培養基。貼壁細胞培養第3天，第5天更換一 半量的培養基。培養第五天，更換含5 %血漿培養基并加入T細胞上清10%，并按照終濃度 加入加入IFNa，培養二十小時之后再加入20ug/ml的poly-I:C。如圖2所示，經過6天的 誘導，制備產物顯示出了明顯的DC細胞的表型，流式細胞術檢測結果顯示CD83,CD86等與 免疫激活相關的標志物達到了 95%W上，說明制備產物中DC細胞純度極高。通過圖4也 可W看出，DCl細胞經過SCD4化刺激之后，高表達IL12,由本發明試劑盒制備的DC細胞表 達的IL12量大約是常規方案的10倍（10%