青霉素結合蛋白抗菌劑的制備及其新用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及青霉素結合蛋白提取物及其新用途，特別是涉及一種青霉素結合蛋白 提取物在抑制果樹或蔬菜真菌中的新用途。
【背景技術】
[0002] 作物病害控制是農業生產中重要的環節，其病原種類多，危害寄主廣，發生面積 大，適應性強，給農業生產造成的損失嚴重而又難于控制。之前主要依靠使用大量化學農藥 來防治植物病害，但是其對環境和人類健康造成了非常大的負面影響。近年來，由于微生物 農藥其具有抗菌譜廣、活性功能多樣化等優點，更加引起對生物農藥的關注。抗菌蛋白具有 相對分子量小、殺菌范圍廣、作用機制獨特等特點，并且具有廣譜抗菌的優點，是理想的化 學農藥替代品。但現有文獻和現實生產中青霉素結合蛋白在制備微生物源抑菌劑中的應用 鮮見報道，本發明的創新之處在于發現了青霉素結合蛋白作為一種新型抑菌蛋白在桃褐腐 病病害上的應用。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種青霉素結合蛋白提取物。
[0004] 本發明的另一目的在提供一種青霉素結合蛋白提取物的新用途。
[0005] 本發明是通過如下技術方案實現的：
[0006] 本發明所述的青霉素結合蛋白提取物加入常規輔料，按照常規工藝，制成各種制 劑，如噴霧劑、乳油、懸浮劑或粉劑。
[0007] 本發明提供了一種與環境兼容性好、對哺乳動物安全的新型微生物源抑菌劑，對 生態良好發展、人類的健康和園藝病害的綜合治理都具有深遠的意義。與傳統的農藥相比， 本發明具有以下的特點和優點：1、可以在細菌中可以超量表達，成本低，可以成為很好的開 發資源；2、該蛋白不造成農藥藥害、毒性殘留，對人畜、生態環境安全；3、該蛋白基因克隆 后，十分有利于進行工業化生產。
[0008] 下述實驗例和實施例用于進一步說明本發明但不限于本發明。
[0009] 實驗例1 :
[0010] 本發明青霉素結合蛋白提取物，由如下方法制成：取胰蛋白胨10重量份，酵母提 取物（如上海津南貿易有限公司或山東煙臺華海生物制品有限公司生產）5重量份，氯化鈉 10重量份，蒸餾水1000體積份，常溫攪拌；用移液槍按照1 %的接種量將菌種金色葡萄球菌 接種入液體培養基中，放入36攝氏度搖床，轉速180轉/分鐘，振蕩培養24小時；將振蕩培 養后的菌體懸液轉入滅菌離心管，置入轉速為8000轉/分鐘的冷凍離心機離心10分鐘，取 上清液；然后對上清液中粗蛋白進行鹽析，再將其用經陰離子柱層析純化，通過液相色譜與 標品對照，獲得該純化物。再于旋轉蒸發儀中濃縮到體積比1 : 100,再將濃縮液放于冷凍 干燥機中冷干，即得青霉素結合蛋白提取物。
[0011] 實驗例2 :
[0012] 本發明抑菌蛋白洗脫峰組分抑菌活性測定，是由如下方法制成：采用平板涂布打 孔法測定，以下工作在超凈臺中進行。取各個組分經過0.22μm濾菌器濾菌。取各個組分 200uL蛋白液分別均勻涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上。以20mmol/L磷酸緩沖液涂在 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基作為空白對照（CK)。用打孔器將長滿桃褐腐的馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培養基打孔。用接菌針將打下來長的瓊脂塊挑下來，有孢子一面向下貼在馬鈴薯葡萄糖瓊 脂培養基中央。每組平行三次。28°C培養，觀察抑菌效果并記錄數據，即對抑菌蛋白洗脫峰 組分進行抑菌活性測定。實驗結果見下表1 :
[0013] 表1青霉素結合蛋白不同流分抑菌效果的影響
[0014]
[0015] 實驗例3 :
[0016] 本發明抑菌蛋白粗提物濃度不同梯度抑菌活性測定，是由如下方法制成：獲得最 佳硫酸銨飽和度后，將最適濃度下的蛋白提取液濾菌后在超凈臺中按照梯度稀釋4個梯 度，取4根已滅菌的試管，第一根試管中加入5ml粗蛋白原液，再將另外三根試管中各加 4.5ml20mmol/L的磷酸鹽緩沖液。取0.5ml原液于第二根試管中，混合均勻，即為10倍稀 釋；然后取〇.5ml10倍稀釋物于第三根試管中，混合均勻，即為100倍稀釋；取0.5ml100 倍稀釋物于第四根試管中，混合均勻，即為1000倍稀釋物。將每個梯度的蛋白液各取200uL 均勻涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上。以20mmol磷酸緩沖液涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培養基作為空白對照（CK)。用打孔器將長滿桃褐腐的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基打孔。用接 菌針將打下來長的瓊脂塊挑下來，有孢子一面向下貼在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中央，每 組平行三次。28°C培養，在4天觀察抑菌效果并記錄數據，即對抑菌蛋白粗提物不同濃度梯 度進行抑菌活性測定。實驗結果見下表2:
[0017] 表2不同濃度青霉素結合蛋白對桃褐腐病菌的影響
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[0019] 表3.青霉素結合蛋白對桃褐腐病的生物活性（4d，平板法）
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[0021] 結果證明，本發明所述青霉素結合蛋白對桃褐腐病真菌有顯著的抑制活性。
[0022] 下述實施例均能實現上述實驗例的效果。
[0023] 實施例1
[0024] 將青霉素結合蛋白加入溶劑、乳化劑、穩定劑等常規輔料，按照常規工藝制成乳 油。
[0025] 實施例2
[0026] 將青霉素結合蛋白加入填料（如滑石粉）和少量助劑經混合、粉碎再混合至一定 細度制成粉劑。
【主權項】
1. 一種青霉素結合蛋白提取物，其特征在于：它是由金色葡萄球菌Staphylococcus aureus Rosenbach 菌株產生的。2. -種青霉素結合蛋白的分離純化，其特征在于：其由如下方法制成： 取胰蛋白胨10重量份，酵母提取物（如上海津南貿易有限公司或山東煙臺華海生物制 品有限公司生產）5重量份，氯化鈉10重量份，蒸餾水1000體積份，常溫攪拌；用移液槍按 照1 %的接種量將菌種金色葡萄球菌接種入液體培養基中，放入36攝氏度搖床，轉速180轉 /分鐘，振蕩培養24小時；將振蕩培養后的菌體懸液轉入滅菌離心管，置入轉速為8000轉 /分鐘的冷凍離心機離心10分鐘，取上清液；然后對上清液中粗蛋白進行鹽析，再將其用陰 離子柱層析純化，通過液相色譜與標品對照，獲得該蛋白的純化物。將其于旋轉蒸發儀中濃 縮到體積比1 : 100,再將濃縮液放于冷凍干燥機中冷干，即得青霉素結合蛋白提取物。3. -種青霉素結合蛋白提取物，其特征在于：抑制的病原真菌為褐腐菌。4. 如權利要求1所述的青霉素結合蛋白在抑制果樹或蔬菜真菌中的應用。5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于所述抑制果樹或蔬菜真菌是指抑制褐腐病。
【專利摘要】本發明公開一種青霉素結合蛋白提取物及其新用途。該蛋白在抗菌方面的功能尚未報告，本發明青霉素結合蛋白提取物通過DEAE-Cellulose陰離子交換層析獲取高純度青霉素結合蛋白，采用平板涂布打孔法測定針對不同濃度青霉素結合蛋白對褐腐病菌的影響。經抗菌譜測定，該蛋白具有廣譜抗菌性，抗菌活性強等優點，同時對哺乳動物安全，不造成農藥藥害、毒性殘留，對人畜、生態環境安全，同時十分有利于進行工業化生產，從而為農業病蟲害的生物防治提供科學依據。
【IPC分類】A01N63/02, C12R1/445, C07K1/36, C07K1/18, C12P21/00, A01P3/00, C07K1/30
【公開號】CN105238830
【申請號】CN201510740837
【發明人】任建軍, 李永平, 李秋水, 張長現, 梁碩, 何文豪
【申請人】北京光禾生物科技有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年11月5日