一種即用型抗體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明提供一種即用型抗體c-erbB-2及其稀釋液，并提供一種免疫組織化學染色中的質量控制上的應用。
【背景技術】
[0002]免疫組織化學技術(Immunohisto Chemistry, IHC)應用抗原與抗體特異性結合的基本原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(如同位素、熒光素、金屬離子和酶等)定位、定性及定量顯示組織細胞內抗原的過程。IHC是目前病理科最常用的確診疾病和診斷疑難病例輔助檢測手段，是腫瘤的個性化治療、預后判斷和藥物選擇主要參考指標。做好IHC的質量控制，是指導疾病的診斷與治療的根基。
[0003]多種因素影響IHC染色效果，包括組織的取材固定、抗原修復手段、封閉和抗體質量等，其中抗體質量是主要決定性因素。為了避免非特異性染色，在IHC操作過程中常選擇特異性強、效價高的單克隆抗體為一抗。即用型抗體是按各公司確定的最佳信噪比的稀釋度，用帶有防腐劑等成分的抗體稀釋劑稀釋的濃縮抗體，具有使用方便、操作簡單等優勢。但在操作過程中我們發現c-erbB-2即用型抗體導致組織切片背景著色或假陽性，因抗體稀釋度不當導致的假陽性反應。因此我們嘗試對即用型抗體c-erbB-2再稀釋后進行操作，確定最佳稀釋比例，以達到高標準化的IHC效果。
【發明內容】
[0004]針對上述問題，本發明提供一種即用型抗體。
[0005]一種即用型抗體，其即用型抗體為即用型抗體c-erbB-2。所述的即用型抗體包括即用型抗體c-erbB-2與抗體稀釋液按體積比1: 2、1: 4、1: 8、1:16稀釋后混合。
[0006]進一步優選為所述的即用型抗體包括即用型抗體c-erbB-2與抗體稀釋液按體積比1:4稀釋后混合。
[0007]本發明將上述的即用型抗體在免疫組織化學染色中的質量控制上的應用。包括如下步驟:
(1)將乳腺癌切除標本切片厚度為3ym，70°C烤片40min，脫蠟至水；
(2)在高溫高壓(120°C、70KPa)下利用pH為8.0的EDTA對乳腺癌切片進行抗原修復，噴氣后計時2.5min，再用流水冷卻，得到修復后的組織抗原，再用3%的H2O2處理1min (浸泡)；
(3)進一步對修復后的組織抗原采用pH為7.2的PBS沖洗3次，每次3min，甩干PBS后迅速滴加即用型抗體或即用型抗體與抗體稀釋液的混合試劑，再37°C置于恒溫培養箱中解育60min ；
(4)重復PBS沖洗操作一次后，再滴加通用型二抗試劑，再在37°C下孵育30min；
(5)重復PBS沖洗操作一次后，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色效果后自來水水洗、蘇木素復染、脫水和封固。
[0008]步驟(3)中，若滴加即用型抗體c-erbB-2，則，即用型抗體c_erbB_2的滴加量為充分覆蓋住組織并略多些。
[0009]若滴加即用型抗體c-erbB-2與抗體稀釋液的混合試劑，則，即用型抗體c_erbB_2與抗體稀釋液的體積比為1: 2、1: 4、1: 8、1:16，其混合試劑的滴加量為充分覆蓋住組織并略多些。步驟(4)中，通用型二抗試劑的滴加量為充分覆蓋住組織并略多些。
[0010]即用型一抗試劑給病理技術人員帶來了方便，不需要重新探討稀釋比例，穩定性好，大大提高了 IHC的操作效率，同時由于國內即用型試劑供應商多采用對國外濃縮型抗體按說明書推薦稀釋比例進行分裝并進行預實驗，保障了 IHC試劑的質量控制。但由于各種操作流程與條件的差異，即用型一抗試劑效果并不理想，必須重新摸索最適抗體稀釋度。IHC操作過程中多種因素影響一抗稀釋度，主要包括固定方法和時長、抗原修復方法、修復液種類和PH、抗體孵育溫度和時長以及檢測系統的敏感性等。本申請中即用型一抗試劑即為本申請的即用型抗體c-erbB-2，經稀釋后的即用型抗體c-erbB-2也為即用型一抗試劑。
【附圖說明】
[0011]圖1為乳腺癌即用型及再稀釋型C-erbB-2抗體的免疫表達，其中，A: c_erbB_2即用型(SP，IHCX 100) ；B: c-erbB-2 再稀釋 1:2 (SP, IHCX 100) ; C: c-erbB-2 再稀釋1:4 (SP，IHCX 100) ; D: c-erbB-2 再稀釋 1:8 (SP，IHCX 100) ; E: c-erbB-2 再稀釋 1:16(SP, IHCX 100) ο
【具體實施方式】
[0012]實施例1
隨機選取三峽大學仁和醫院手術室送檢的乳腺癌切除標本共60例。每例標本規范化取材固定、脫水、透明、浸蠟及包埋。
[0013]試劑
即用型兔抗人c-erbB-2單克隆抗體(Catalog#JY_0044)和抗體稀釋液均購自Thermo公司，顯色系統購自DAKO公司。
[0014]儀器
隔水式電熱恒溫培養箱(HENGZI，上海躍進)。
[0015]染色步驟
IHC染色采用SP法。實驗過程中所有試劑現配現用。再稀釋型一抗采用1:2、1:4、1:8和1:16四個梯度比例。本文所述的一抗或即用型一抗均指即用型抗體c-erbB-2或即用型抗體c-erbB-2與抗體稀釋液的混合液。
[0016](I)實驗中所有切片厚度統一 3ym，70°C烤片40min，脫蠟至水。(2)在高溫高壓下利用EDTA (pH 8.0)對組織抗原進行修復，時長2.5min (噴氣后開始計時)，流水快速冷卻。(3)使用3%H202處理lOmin。(4) PBS (pH 7.2)沖洗3次，每次3min，甩干PBS后迅速滴加即用型及再稀釋型一抗試劑50 μ L，置于恒溫培養箱(37°C)中孵育60min。(5)重復PBS操作，滴加通用型二抗試劑50 μ L，37°C孵育30min。(6)重復PBS操作，滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色效果(顯色時長約1min)后自來水水洗、蘇木素復染、脫水和封固。
[0017]基于固定方法、固定時間和組織處理過程相對一致前提下，抗體最適稀釋濃度是以得到最弱的背景染色和最大強度的特異性染色為標準。本實驗選取的60例標本所得出的實驗結果一致。
[0018]即用型抗體c-erbB-2與四個濃度梯度比例的切片IHC染色情況如圖1所示。不同稀釋濃度梯度比例均有陽性表達，其中以稀釋1:4組染色效果最為理想(圖1C)，即ImLc-erbB-2即用型工作液中加入4 mL抗體稀釋液時陽性切片特異性染色最強，著色均勻，陽性部位與陰性部位界線清晰、對比度最佳。而當稀釋濃度比例為1:16時(圖1E)，切片中強陽性部位組織僅表達弱陽性，此時稀釋濃度過大，不能達到檢測要求。
[0019]在IHC操作中部分即用型抗體導致組織切片出現背景著色，主要原因是即用型抗體濃度過高，而IHC染色質量控制要求組織切片以最弱的背景染色和最大強度的特異性染色為標準，所以在實際操作中需要對即用型抗體進行再稀釋。上述實驗數據表明，對于c-erbB-2即用型選用最佳的抗體稀釋濃度非常重要，其最佳抗體稀釋濃度為1:4，但并不是每一種即用型抗體都要進行再稀釋，同樣每種抗體的再稀釋濃度也存在差異，因此選用最佳的抗體的再稀釋濃度尤為重要。即用型抗體再稀釋對大多數抗體來說能達到理想的染色結果，是一種值得推廣使用的IHC質量控制方法。
[0020]IHC技術可以判斷腫瘤性質、腫瘤來源、細胞屬性、增殖活性，并指導腫瘤的治療與預后，廣泛應用于臨床病理診斷與治療工作中。IHC技術地位的重要性，要求每一個病理技術工作人員把好質量控制關，正確認識和努力避免由于技術缺陷和不足給診斷帶來的誤區。在實際工作中我們應該在參考抗體使用說明書的同時，通過病理醫生和病理技術人員的合作、學習和探索，結合自身條件，優化和篩選技術操作方法，尋找最佳的抗體稀釋度，提高IHC技術水平，更好發揮IHC技術的指導作用。
【主權項】
1.一種即用型抗體，其特征在于，其即用型抗體為即用型抗體c-erbB-2。2.權利要求1所述的即用型抗體還包括即用型抗體c-erbB-2與抗體稀釋液按體積比1:2、1:4、1:8、1:16 稀釋后混合。3.權利要求2所述的即用型抗體還包括即用型抗體c-erbB-2與抗體稀釋液按體積比1:4稀釋后混合。4.權利要求1-3任一項所述的即用型抗體在免疫組織化學染色中的質量控制上的應用。5.權利要求4所述的應用，其特征在于，包括如下步驟: 1)將乳腺癌切除標本切片厚度為3ym，70°C烤片40min，脫蠟至水； 2)在70KPa、120°C的高溫高壓下利用pH為8.0的EDTA對乳腺癌切片進行噴氣式組織抗原修復，修復2.5min，再用流水冷卻，得到修復后的組織抗原，再用3%的H2O2浸泡1min ； 3)進一步對修復后的組織抗原采用pH為7.2的PBS沖洗3次，每次3min，甩干PBS后迅速滴加即用型抗體c-erbB-2或即用型抗體c_erbB_2與抗體稀釋液的混合試劑，在37°C置于恒溫培養箱中孵育60min ; 4)重復PBS沖洗操作一次后，再滴加通用型二抗試劑，再在37°C下孵育30min; 5)重復PBS沖洗操作一次后，滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色效果后自來水水洗、蘇木素復染、脫水和封固。6.權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟(3)中，若滴加即用型抗體c-erbB-2，則，即用型抗體c-erbB-2的滴加量為充分覆蓋住組織抗原； 若滴加即用型抗體c-erbB-2與抗體稀釋液的混合試劑，則，即用型抗體c_erbB_2與抗體稀釋液的體積比為1: 2、1: 4、1: 8、1:16，其混合試劑的滴加量為充分覆蓋住組織抗原。7.權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟(4)中，通用型二抗試劑的滴加量為充分覆蓋住組織抗原。
【專利摘要】本發明提供一種即用型抗體及其稀釋液，即，采用SP法，選擇即用型抗體c-erbB-2單克隆抗體原液、再稀釋液1:2、1:4、1:8和1:16進行免疫組織化學檢查，c-erbB-2即用型工作液最適稀釋濃度為1:4，得到最弱的背景染色、最大強度的特異性染色、最佳對比度的染色結果。即用型抗體再稀釋是一種值得推廣使用的免疫組織化學質量控制方法。
【IPC分類】G01N33/574, G01N33/577
【公開號】CN105067816
【申請號】CN201510416683
【發明人】王曉星, 易慕華, 方捷迪, 張夢玲
【申請人】三峽大學
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月16日