給藥后體重變化。
【具體實施方式】
[0056] 結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明。實施本發明的過程、 條件、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發 明沒有特別限制內容。
[0057] 實施例一、PEG-3, 4-DA的合成
[0058] 稱取3,4-二羥基苯乙酸（0.1268,0.750臟〇1)，加入1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（0. 154g，0. 800mmol)，1-羥基苯并三唑（0. 108g，0. 800mmol)， N,N-二異丙基乙胺（0· 260ml, 1. 500mmol)，PEG-NH2(1. 000g, 0· 500mmol)及 30ml無水二氯 甲烷于反應瓶中，氮氣保護，室溫反應12h，濃縮后加入超純水溶解，二氯甲烷萃取數次，濃 縮液拌樣過柱純化（二氯甲烷：甲醇=30:1)。將純化后的產物濃縮后滴加到50ml冰乙醚 中，過濾洗滌數次后干燥得到白色粉末PEG-3, 4-DA0. 840g，產率78 %。
[0059] 所述PEG-3, 4-DA的結構式如如式（5)所示；
[0060]
[0061] 實施例二、PEG-BC的合成
[0062] 稱取PEG-3, 4-DA(0· 430g, 0· 200mmol)，3-氨基苯硼酸（0· 137g, 1.OOOmmol)，及 100ml重蒸后的甲苯置于Dean-Stark除水裝置中，120°C加熱8h，濃縮后加入10ml無水四 氫呋喃溶解，轉移至截留分子量為2000的透析袋中在無水四氫呋喃溶劑中透析24h后滴加 到50ml冰乙醚中，過濾洗滌數次后干燥得到淡黃色粉末PEG-BC0. 360g，產率80%。
[0063] 所述PEG-BC的結構式如式（6)所示；
[0064]
[0065] 實施例三、PEG-BC-PBLG的合成
[0066] 稱取PEG-BC((X897g,(λ400mmol)，5-芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環內酸酐 (BLG-NCA) (0. 500g，2.OOOmmol)，及30ml無水四氫呋喃于反應瓶中，氮氣保護，室溫反應 12h，濃縮后轉移到截留分子量為3500的透析袋中，透析12h，將透析液濃縮后滴加到50ml冰乙醚中，過濾洗滌數次后干燥得到終產物PEG-BC-PBLG1. 244g，產率95%。
[0067] 所述PEG-BC-PBLG的結構式如下式（I)所示；
[0068]
[0069] 實施例四、FITC標記PEG-BC-PBLG及對照聚合物PEG-PBLG的合成
[0070] PEG-BC-PBLG與FITC室溫反應12h后，乙醚洗去過量FITC可得 PEG-BC-PBLG-FITC。同法，可用PEG-NH2開環BLG-NCA制得PEG-PBLG及PEG-PBLG-FITC。
[0071] 所述PEG-BC-PBLG的結構式如下式（I)所示；
[0072]
[0073] 所述PEG-PBLG的結構式如下式（7)所示：
[0074]
[0075] 實施例五、PEG-BC0PBLG膠束的組裝
[0076] 將2mgPEG-BC-PBLG溶于0· 5mL二氯甲烷中，滴加入攪拌速度為500r/min的10mL 超純水中，用0. 45μm的針式過濾器過濾，裝入透析袋透析48h(每6h換一次超純水），冷凍 干燥，制得所述PEG-BC0PBLG膠束凍干粉。TEM觀察其為球形形貌，動態光散射測得其平均 粒徑約為80nm，與DLS結果吻合。
[0077] 實施例六、載阿霉素膠束PEG-BC0PBLG·Dox的制備
[0078] 取 10mgPEG-BC-PBLG和 2mgDox溶于 1mlDMS0 中，滴加入攪拌速度為 500r/min 的20mL超純水中，用0. 45μm的針式過濾器過濾，裝入透析袋透析48h(每6h換一次超純 水），冷凍干燥，制得PEG-BC0PBLG·Dox。
[0079] 芘熒光探針法測定其臨界膠束濃度（CMC)，稱取一定量芘溶解于乙醇中，室溫下讓 乙醇揮發，配置上述膠束濃度范圍從1X10 5到5X10ig/mL，分別加入含有芘的玻璃小瓶 中，芘的濃度固定在6X10 7mg/mL，用熒光光度計測得各濃度下熒光值，計算出臨界膠束濃 度為 3. 5X102mg/mL。
[0080] 用紫外吸收法測定其載藥量（DLC)和包封率（DLE)，將制備的載阿霉素膠束 PEG-BC0PBLG·Dox粉末溶于DMS0中，測定其在480nm處的紫外吸收值，與Dox的標準工作 曲線對照，計算得載藥量和包封率分別為8. 5%和42. 5%。
[0081] 載藥量（DLC% )=(膠束中Dox的質量/聚合物的質量）X100%
[0082] 包封率（DLE% )=(膠束中Dox的質量/Dox投料的質量）X100%。
[0083] 所述載阿霉素納米膠束PEG-BC0PBLG·Dox的示意圖如圖1A所示。
[0084] 實施例七、PEG-BC-PBLG嵌段聚合物及PEG-BC0PBLG膠束的酸降解性能
[0085] 用1HNMR研究了嵌段聚合物PEG-BC-PBLG的降解情況，其中用ρΗ7· 4介質模擬正 常血液的pH，ρΗ6. 5、pH6. 0、pH5. 0介質分別模擬腫瘤組織、內涵體、溶酶體的pH。用D20 配置pH分別為 7· 4、6· 5、6· 0、5· 0 的Na2HP04/NaH2P04緩沖液，分別取 10mgPEG-BC-PBLG溶 于lmLDMS0-D6中，加入100μL的各pH緩沖液，混勻后每小時掃一次1HNMR。
[0086] 用DLS測定膠束在pH緩沖液中粒徑的變化能反應PEG-BC0PBLG膠束的降解情況。 取lmgPEG-BC0PBLG凍干膠束溶解在5mL各pH緩沖液中，監測粒徑變化情況。30min后在 pH6. 5,pH6. 0,pH5. 0介質中其粒徑變化。
[0087] 實施例八、PEG-BC0PBLG·Dox膠束在不同pH介質中的釋藥行為
[0088] 用紫外分光光度計測定PEG-BC0PBLG，D〇X膠束在pH緩沖液的釋藥性能。取25mL PEG-BC0PBLG·?οχ(0. 2mg/mL)分別置于pH7. 4,6. 5,6. 0,5. 0 緩沖液中透析 24h(MWC02000)， 紫外分光光度計分別測得透析后各組的吸光度，與測得Dox的標準曲線對照，計算出各組 釋藥量。
[0089] 實施例九、PEG-BC0PBLG納米膠束的細胞吞噬行為
[0090] 將HepG2細胞和HL7702細胞在四格培養皿（Greiner)上預培養 24h(10X104cells/孔）后，分別加入3mLpH為7. 4,6. 5,6. 0, 5. 0的培養基，其中每組各含 PEG-BC0PBLG-FITC和PEG@PBLG-FITC(0. 4mg/mL)，繼續培養 3h后，PBS(pH7. 4)清洗數次， 消化后離心收集，用流式細胞儀對各組細胞熒光強度進行測定。
[0091] 實施例十、載阿霉素PEG-BC0PBLG·Dox膠束的細胞毒性研究
[0092] 為研究PEG-BC0PBLG·Dox的體外細胞毒性，無硼酸酯鍵的載藥膠束PEG0 PBLG·Dox被制備用于毒性研究的對照實驗。對PEG-BC0PBLG膠束，無硼酸酯鍵的載藥膠束 PEG0PBLG.Dox，載阿霉素膠束PEG-BCOPBLG.Dox及未被膠束包裹的Dox在ρΗ7· 4和ρΗ5· 0 條件下進行肝癌細胞ifepG2毒性測試。細胞培養方法為：將處于對數生長期的Η印G2細胞 接種于96孔板上每孔180μL，恒溫培養箱中培養細胞數達到80%后，每組分別加入20μL 含有一系列濃度梯度的PEG-BC0PBLG，PEG0PBLG·Dox，PEG-BC0PBLG·Dox及Dox，濃度均以 D〇x含量為標準分別為3. 25, 7. 5,15, 30,60和120μg/mL，培養24h;加入10μLMTT溶液 (5mg/mL)后繼續培養4h，吸去培養基加入100μLDMS0溶解甲瓚晶體，用酶標儀于570nm波 長處測定吸光度。細胞存活率計算如下：
[0093] 細胞存活率（％ )=(0D實驗組_0D空白組/0D對照組_0D空白組）X100%
[0094] 實施例^^一、PEG-BC0PBLG·Dox膠束抑制肝癌生長活性評價
[0095] 選取健康活潑的BALB/c-nu裸鼠（鼠齡6周，體重18-20g)，于左側腋下接種鼠源 肝癌細胞ifepG2,接種細胞密度為每只100μL細胞數為5X107 (其中BD-Martrigel基質膠 與細胞體積比為1:1)。當腫瘤長到約5_左右時（設定為第0天），荷瘤裸鼠被隨機分成4 組（組間鼠重大致相同），每組6只。將生理鹽水、PEG-BCOPBLG、PEG-BCOPBLG·Dox及Dox 按5mg/kg(Dox含量為標準）尾靜脈注射，每三天注射一次，連續注射5次，用游標卡尺測量 腫瘤的尺寸，并按下式計算腫瘤體積V:
[0096] V(mm3) = (a.b2·π)/6
[0097] 其中a,b分別為腫瘤最大和最小尺寸。
[0098] 本發明的保護內容不局限于以上實施例。在不背離發明構思的精神和范圍下，本 領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求書為保 護范圍。
【主權項】
1. 一種以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物，其特征在于，所述兩嵌段聚合物的結 構式如式（I)所示，式⑴中： X = 40-120 m = 5-20 〇2. -種以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物的合成方法：其特征在于，所述方法包 括以下步驟：（1)合成PEG-NH2的多巴衍生物PEG-3, 4-DA ; (2)PEG-3, 4-DA與3-氨基苯硼 酸脫水縮合，得到PEG的苯硼酸酯衍生物PEG-BC ; (3)以PEG-BC作為大分子引發劑對5-芐 酯-L-谷氨酸-N-羧基環內酸酐（BLG-NCA)進行開環聚合，得到所述以苯硼酸酯為連接單 元的兩嵌段聚合物PEG-BC-PBLG。3. 根據權利要求2所述方法制備的以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物，其特征在 于，所述兩嵌段聚合物結構如式（I)所示。4. 將權利要求1所述的以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物用于制備藥物載體的 應用。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述藥物為脂溶性藥物。6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述脂溶性藥物為阿霉素、吉西他濱、 SN38、紫杉醇。7. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述藥物載體為納米膠束載體。8. 如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述納米膠束載體為酸敏感型。9. 如權利要求7或8所述的應用，其特征在于，所述納米膠束載體用于增強腫瘤細胞的 內吞特性。
【專利摘要】本發明公開了一種以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物，以苯硼酸兒茶酚酯(BC)為連接單元，合成聚乙二醇-聚谷氨酸兩嵌段聚合物(PEG-BC-PBLG)，進而構建其載阿霉素膠束(PEG-BCPBLG·Dox)。本發明還公開了制備所述兩嵌段聚合物的方法，包括(1)制備PEG-NH2的多巴衍生物PEG-3,4-DA；(2)PEG-3,4-DA與3-氨基苯硼酸脫水縮合，合成PEG的苯硼酸酯衍生物PEG-BC；(3)PEG-BC開環5-芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環內酸酐(BLG-NCA)，即以PEG-BC作為大分子引發劑對5-芐酯-L-谷氨酸-N-羧基環內酸酐(BLG-NCA)進行開環聚合，得到所述以苯硼酸酯為連接單元兩嵌段聚合物PEG-BC-PBLG。本發明制備的兩嵌段聚合物可以用于構筑納米膠束載體，具有較好的釋藥性，較低的細胞毒性和良好的細胞吞噬性。
【IPC分類】A61K47/34, A61K31/704, A61K31/7068, A61K31/4745, A61P35/00, C08G83/00, A61K9/107, A61K31/337
【公開號】CN105273205
【申請號】CN201510648789
【發明人】余家會, 徐琰, 徐艷昀, 高雅
【申請人】華東師范大學
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年10月9日