膠原特異結合的單鏈抗體、其編碼基因及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種治療性抗體，特別涉及一種具有膠原特異性結合能力的單鏈抗體、其制備方法及在腫瘤治療中的應用。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，在動物體內約30%都為膠原蛋白成分，膠原蛋白在細胞的粘附、迀移、分化、增殖等過程中發揮著重要作用，大量研究表明，在腫瘤細胞發生的部位相對于正常組織膠原蛋白過表達，膠原蛋白在腫瘤的發生和轉移過程中為腫瘤細胞提供信號轉導、物理支架等。目前，針對腫瘤細胞表面靶點的藥物越來越多的被發現和研究，并且在體外實驗中獲得良好的腫瘤細胞的殺傷效果，但是在體內試驗中由于腫瘤細胞表面過表達的細胞外基質形成了保護腫瘤細胞的微環境，對腫瘤組織起到了保護作用。細胞外基質成為了腫瘤藥物到達腫瘤組織的障礙，大大降低了抗體藥物或化學藥物到達腫瘤組織的速度和濃度，降低了藥效。例如，膠原蛋白作為細胞外基質的主要成分成為了藥物到達腫瘤部位的一個屏障，但是，同時膠原蛋白也成為了腫瘤靶向治療和制備靶向遞送藥物載體的重要的新靶點。
[0003]為了提高藥物在腫瘤組織的濃度，一般采用兩種方法，其中第一種方法是:首先通過使用促進膠原蛋白降解的藥物促進腫瘤部位膠原的降解，進而使用針對腫瘤的藥物進行治療。這種方法雖然證實是有效果的，但是靶向性較低，使用范圍具有局限性；第二種方法是目前使用較多的方法，使用針對細胞外基質的抗體與具有腫瘤治療效果的蛋白或者是藥物利用基因工程方法改造或者化學交聯后，利用抗體的特異性結合靶向遞送藥物到腫瘤外基質，形成殺傷腫瘤細胞的微環境。但是，利用抗體分子靶向治療腫瘤時，由于抗體分子量較大，過表達的膠原造成腫瘤組織內壓較高，同時實體瘤內部血管較少，抗體藥物復合物穿透血管到達腫瘤內部速度較慢，難以起到有效殺傷腫瘤的效果；并且由于在體內循環周期較長，容易引起較大的免疫反應，副作用明顯。
[0004]革E1向性多肽的出現很好的彌補了抗體分子作為革G向治療的缺點，多肽分子分子量較小、結構簡單通過化學合成易于獲得、氨基酸序列易于分析大大降低了免疫原性，并且組織滲透能力相對于大分子量的蛋白或者抗體要快很多。因此，利用靶向性多肽與治療性藥物結合成為靶向治療腫瘤或者細胞成像的新方法，從80年代起第一個靶向多肽開始在臨床使用，截止到目前已經有50多種靶向多肽被批準臨床使用，500多種靶向多肽在臨床前研究階段。西妥昔單抗(cetuximab，商品Erbitux)是抗人表皮生長因子(EGFR)的嵌合型IgGi單克隆抗體，是鼠人嵌合的單克隆抗EFGR抗體，在兩個重鏈上存在兩個N-連接的糖基化位點，分子量在152kD左右，它可以與EGFR受體胞外域高親和力結合，從而競爭性拮抗配體與EGFR的結合，封閉受體與配體的結合從而起到抑制配體介導的EGFR酪氨酸激酶的激活，試驗表明，腫瘤細胞或者腫瘤微環境中多種有EGFR信號介導的通路被阻斷等，它于2004年被美國食品藥品管理局批準使用治療直腸癌，2006年批準用于治療頭頸部腫瘤。但是此類全長抗體因分子量較大，較難克服腫瘤內壓，穿透血管到達腫瘤部位的速度較慢，同時由于全長抗體在體內循環周期較長，容易引起較大的免疫反應，副作用明顯；這些因素極大的降低了全長抗體的治療效果。
【發明內容】
[0005]針對現有技術的不足，本發明的主要目的在于提供一種膠原特異結合的單鏈抗體，其主要由膠原特異結合多肽CBD與西妥昔單抗的scFv功能區融合形成。
[0006]在一更為具體的實施方案之中，所述膠原特異結合的單鏈抗體(CBD-scFv)是由具有SEQ ID NO: 1所示序列的基因編碼形成。
[0007]本發明還提供了用以編碼所述膠原特異結合的單鏈抗體的基因。
[0008]在一更為具體的實施方案之中，所述基因具有SEQ ID NO: 1所示序列。
[0009]本發明還提供了所述膠原特異結合的單鏈抗體及其編碼基因的用途。
[0010]例如，作為其中的應用方案之一，本發明提供了一種含有用以編碼膠原特異結合的單鏈抗體的基因的表達盒、重組載體、重組菌或轉基因細胞系。
[0011]又例如，作為其中的應用方案之一，本發明提供了所述膠原特異結合的單鏈抗體于制備產品中的應用，并且所述產品至少具有下列功能中的一種:檢測腫瘤細胞，輔助鑒定腫瘤細胞，預防和/或治療腫瘤，預防和/或治療由腫瘤細胞誘發的疾病。
[0012]又例如，作為其中的應用方案之一，本發明提供了一種藥物，其包含所述膠原特異結合的單鏈抗體。
[0013]又例如，作為其中的應用方案之一，本發明提供了一種用于預防或治療腫瘤的藥物組合物，其包含所述膠原特異結合的單鏈抗體和藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0014]與現有技術相比，本發明的優點包括:利用酵母表達系統，通過基因工程方法將膠原結合區(CBD，Collagen binding domain)多肽與西妥昔單抗(cetuximab)的功能區scFv (single-chain antibody fragment)融合表達，獲得的CBD-scFv在酵母表達系統中上清表達，并且通過體外實驗和體內實驗證明，CBD-scFv可以與膠原蛋白特異性結合，并且保留了 cetuximab與腫瘤細胞表面的EGFR結合能力以及對腫瘤細胞生長的抑制作用，在體內CBD-scFv可以革El向性的在膠原富集的腫瘤發生部位聚集，并且相對于全長抗體cetuximab能更快的靶向到腫瘤部位，在腫瘤靶向治療和載藥領域有良好應用前景。
【附圖說明】
[0015]圖1是CBD-scFv和ΝΑΤ-scFv的基因克隆與質粒線性化的電泳圖，其中1為NAT-scFv,2 為 CBD-scFv,3 為 pPICZa -CBD-scFv,4 為 pPICZα -ΝΑΤ-scFv ；
[0016]圖2a是CBD-scFv的構建模式圖；
[0017]圖2b是純化后的CBD-scFv和NAT-scFv的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖；
[0018]圖2c是CBD-scFv和ΝΑΤ-scFv與膠原蛋白的結合釋放曲線圖；
[0019]圖3a是CBD-scFv和NAT-scFv與A431細胞表面的EGFR受體的特異性結合的熒光顯微鏡照片；
[0020]圖3b是CBD-scFv和NAT-scFv與EGFR的結合的流式細胞儀檢測曲線圖，其中實線代表陰性對照，虛線代表試驗組；
[0021]圖4是MTT法檢測CBD-scFv和NAT-scFv對A431腫瘤細胞增殖影響的曲線圖；
[0022]圖5a是CBD-scFv和NAT-scFv對A431腫瘤細胞凋亡的流式細胞儀檢測圖；
[0023]圖5b是CBD-scFv和NAT-scFv對A431腫瘤細胞凋亡的流式細胞儀檢測的統計圖；
[0024]圖6a圖6b分別是腫瘤組織的H&E和Masson染色照片；
[0025]圖7是以流式細胞儀分析CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在A431腫瘤部位存留的曲線圖；
[0026]圖8a是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在A431腫瘤部位存留的免疫熒光照片；
[0027]圖8b是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在A431腫瘤部位存留的免疫熒光照片的熒光平均光密度值/面積統計圖；
[0028]圖9a是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔治療四周后腫瘤體積變化圖；
[0029]圖9b是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔治療四周后腫瘤的最終瘤重圖；
[0030]圖10a是CBD-SCFV、NAT-SCFV和西妥昔治療四周后的腫瘤組織的免疫熒光染色照片;
[0031]圖10b是CBD-SCFV、NAT-SCFV和西妥昔治療四周后的腫瘤組織的免疫熒光染色的平均光密度值/面積的統計圖。
【具體實施方式】
[0032]如前所述，鑒于現有技術存在諸多缺陷，本案發明人經長期研究和大量實踐，制備了一種具有膠原特異結合的單鏈抗體(CBD-scFv)，其中利用膠原特異結合多肽CBD與治療性抗體的功能區，例如cetuximab的scFv功能區融合表達，并優選采用酵母表達系統成功獲得了 CBD-scFv融合抗體片段，該CBD-scFv在體外和體內均具有很好的膠原特異結合能力，并且保持了與EGFR的結合能力和抗腫瘤的活性，CBD-scFv可以很快的在腫瘤發生部位富集，對腫瘤細胞發揮殺傷作用。
[0033]以下結合附圖及較佳實施例對本發明的技術方案作更為詳盡的說明。
[0034]1、CBD-scFv在酵母菌中的高效表達與純化
[0035]1、CBD-scFv表達載體的構建
[0036]CBD-scFv抗體的\和V H鏈由蘇州金維智生物科技有限公司合成。然后，利用overlap PCR 將 CBD (TKKTLRT)、VL和 V H拼接成 CBD-scFv 鏈，連接順序如下:XhoI+CBD+linker+VL+linker+VH+NotL.進一步的，CBD-scFv 的編碼基因序列(SEQ ID NO: 1)如下:
[0037]CTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCAACCAAGAAGACCTTACGCACAAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGTGGTGGTGGCGGTGATATCTTACTGACACAGAGCCCGGTGATCCTG