利用聯合抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及利用聯合抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產量的方法。
【背景技術】
[0002]目前許多自主開發的新型農用抗生素只是停留在實驗室階段，其中關鍵的原因就是生產菌的產素水平未達到工業化要求。所以，當前擺在研究工作者面前一個主要的問題就是提高現有和正在開發的農用抗生素生產菌的產素水平，加快農用抗生素的產業化進程。常規的微生物誘變育種費時費力、隨機性高，通過基因工程手段已可實現單基因編碼的酶類的定向進化并進行超量表達，但對需要成簇基因編碼的抗生素等天然產物的產量提高則困難重重。研究表明聯合抗藥性突變篩選方法是一種新穎的優化抗生素產生菌的新方法，聯合抗藥性突變可加強微生物合成抗生素的水平，并且這一優化菌株的新方法能夠應用于多種抗生素生產菌株的優化并且能夠提高野生型菌株的抗生素產量。
[0003]豐加霉素能抑制多種病原真菌的生長，具有廣闊的生防應用前景。淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomyces diasta tochromogenes)V>能合成豐加霉素，利用聯合抗藥性突變篩選方法改良淀粉酶產色鏈霉菌使其提高豐加霉素合成能力的研究未見有報道。
【發明內容】
[0004]本發明通過聯合抗藥性突變株的篩選，獲得對低濃度鏈霉素、高濃度鏈霉素和巴龍霉素都產生抗藥性的淀粉酶產色鏈霉菌D的突變株，獲得的突變株產豐加霉素的能力比淀粉酶產色鏈霉菌D顯著提高。該發明為提高豐加霉素的產素水平提供了一種可靠的方法。
[0005]本發明的目的是針對野生型菌株淀粉酶產色鏈霉菌D產豐加霉素水平低的不足，提供一種提高豐加霉素產素水平的方法；本發明的另一目的是提供了一株高產豐加霉素的淀粉酶產色鏈霉菌D突變株。
[0006]本發明目的通過以下技術方案來實現:
利用聯合抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產量的方法按以下步驟進行:
(I)低濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第一輪抗藥性突變株篩選)
淀粉酶產色鏈霉菌(Strep tomyces dias ta tochromogenes)，定名為淀粉酶產色鏈霉菌Do該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號CGMCC N0.2060。前期研究表明用GYM固體培養基培養，鏈霉素抑制淀粉酶產色鏈霉菌D的MIC值為20 μ g/mL。
[0007]制備鏈霉素終濃度為100 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為100 μ g/mL。GYM固體培養基組分與濃度為葡萄糖4 g/L，Dried yeast extract 4g/L, Dried Malt extract-S 10 g/L, N-Z-Amine A I g/L，NaCl 2 g/L，OB 溶液 600 μ L,定容后用2 mol/L NaCl溶液調節pH至7.3，瓊脂20 g/L ;其中OB溶液配置方法:稱取MgS04.7H20 25g，CuSO4.5H20 2.5g, FeSO4.7H20 3.75g, MnSO4.5H20 1.8g，CaCl2.2H2017.5g，ZnSO4.7H20 4.5g，加500 mL水，用前搖勻；用移液槍吸取1000 μ L淀粉酶產色鏈霉菌D孢子懸液(I X 16個/mL)于含有100 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養箱培養7天，分別挑取單菌落至新的含有100 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個單菌落劃一個平板)，置28 °C培養箱培養5天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為低濃度鏈霉素抗性突變株。
[0008](2)高濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第二輪抗藥性突變株篩選)
制備鏈霉素終濃度為2000 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為2000 μ g/mL。GYM固體培養基組分與濃度同步驟(I);用移液槍吸取1000 μ L低濃度鏈霉素抗性突變株(也即第一輪抗藥性篩選獲得的突變株)孢子懸液(I X 112個/mL)于含有2000 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養箱培養10-15天，分別挑取單菌落至新的含有2000 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個單菌落劃一個平板)，置28 °C培養箱培養7~10天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為高濃度鏈霉素抗性突變株。
[0009](3)巴龍霉素抗性突變株的獲得(第三輪抗藥性突變株篩選)
制備巴龍霉素終濃度為50 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中巴龍霉素濃度為50 μ g/mL。GYM固體培養基組分與濃度同步驟(I);用移液槍吸取1000 μ L第二輪篩選獲得的突變株孢子懸液(I X 112個/mL)于含有50 μ g/mL巴龍霉素的GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養箱培養10~15天，分別挑取單菌落至新的含有50μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個單菌落劃一個平板)，置28 °C培養箱培養7~10天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為巴龍霉素抗性突變株。
[0010](4)突變株發酵培養
發酵培養:發酵培養液為每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黃豆粉40 g，NH4Cl 3 g，CaCO3 5 g, MgSO4 2 g，余量為水；每300 mL三角瓶裝60 mL發酵培養液，配制后121 °C滅菌20 min，待冷卻至50 °C，無菌條件下分別挑取一鈾金環淀粉酶產色鏈霉菌D和抗藥性突變株孢子接種，28 °C±1 °C，發酵培養6天；發酵液經5000 r/min離心10 min，上清液用于豐加霉素含量的測定。
[0011](5)豐加霉素的檢測
方法:采用SHIMADZU C18色譜柱(150 mmX4.6 mm, 5 μπι)，甲醇為流動相Α，水為流動相 B，梯度洗脫，洗脫程序為 0-15 min，5%-37% A ； 15-30 min，37%_100% A ;30_40 min,100%-5% A;流速 1.0 mL/min，檢測波長 279 nm，柱溫 30 °C。
[0012]本發明的有益效果:
一是本發明通過聯合抗藥性突變株的篩選，獲得的突變株合成豐加霉素的能力比淀粉酶產色鏈霉菌D顯著提高，這為提高豐加霉素的產量提供了一種可靠的方法；
二是本發明提供了一