穩定沉默pkm2基因表達的結腸癌細胞株的制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種穩定沉默PKM2基因表達的結腸癌細胞株的制備方法，包括人PKM2基因的shRNA慢病毒表達載體的構建，慢病毒的包裝、收獲，DLD1結腸癌細胞慢病毒感染，穩定細胞株嘌呤霉素篩選和Real-time?PCR、Western?blot鑒定。實驗結果證明，shRNA寡核苷酸序列可成功插入pLKO.1-puro表達載體中，且對PKM2基因表達的抑制效果顯著、持續且穩定。制得的細胞株為研究PKM2在大腸癌細胞能量代謝、增殖、遷移和炎癥等惡性特征中的調控作用提供實驗材料。
【專利說明】穩定沉默PKM2基因表達的結腸癌細胞株的制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】，具體是一種穩定沉默PKM2基因表達的結腸癌細胞株的制備方法，以及得到的細胞株在研究PKM2調控大腸癌細胞能量代謝、增殖、遷移和炎癥等惡性特征中的應用。
【背景技術】
[0002]葡萄糖代謝異常是腫瘤細胞的一個重要特征。腫瘤細胞即使在有氧存在的情況下，也主要通過糖酵解而不是氧化磷酸化進行代謝，消耗大量葡萄糖并產生乳酸，即“Warburg效應”。越來越多的研究認為，糖酵解過程中產生的許多中間產物能夠被腫瘤細胞所用，以合成蛋白質、核酸及脂類等生物大分子，為腫瘤細胞的生長和增殖提供必需的物質
基礎。
[0003]丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)是糖酵解途徑中一個重要的限速酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸轉化。在哺乳動物細胞中，存在PKM1、PKM2、PKL和PKR四種同工酶，其中PKL和PKR由相同的基因PKL編碼，通過不同的組織特異性啟動子而分別表達于肝臟和紅細胞中；PKM1和PKM2由PKM基因編碼，是前體mRNA經不同選擇性剪切的產物，PKMl包含外顯子9，主要表達于骨骼肌和腦組織；PKM2包含外顯子10，主要表達于胚胎組織以及增殖的細胞，尤其是腫瘤細胞中。
[0004]研究表明，腫瘤細胞特異性高表達PKM2在促進腫瘤細胞“Warburg效應”中發揮重要作用。PKM2可以通過調控糖酵解、磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑為腫瘤細胞提供大量增殖所必須的中間產物。此外，PKM2還具有重要的信號轉導功能，它參與調控P-catenin、HIF-1a、NF-K B等重要信號促進腫瘤細胞對微環境的適應。然而，PKM2是否對腫瘤其它惡性特征發揮作用目前還不清楚。本發明通過慢病毒轉染獲得PKM2穩定低表達細胞株，為進一步探討PKM2在腫瘤細胞能量代謝及其它惡性特征中的調控作用提供了有力工具。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種穩定沉默PKM2基因表達的DLDl穩定細胞株，為研究PKM2在大腸癌細胞能量代謝、增殖、遷移和炎癥等惡性特征中的調控作用提供實驗材料。
[0006]本發明提供一種穩定沉默PKM2基因表達的DLDl穩定細胞株的制備方法，包括如下步驟:
[0007](I) shRNA寡核苷酸序列的設計:根據PKM2基因的mRNA全序列，經Blast同源性比對證實特異性后應用RNA Structure4.4軟件對革E mRNA序列的二級結構進行評估得到革巴核苷酸序列，設計并合成靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列:SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:
2；
[0008](2) shRNA慢病毒表達載體的構建和鑒定:將合成的shRNA寡核苷酸:SEQ ID NO:
1、SEQ ID NO:2等量混合，退火形成雙鏈的shRNA，同時雙酶切pLK0.1-puro載體，電泳，切膠回收載體，用T4DNA連接酶將雙鏈shRNA連接到載體pLK0.Ι-puro上，轉化大腸桿菌感受態，克隆擴增獲得pLK0.l-puro-shPKM2重組質粒，重組質粒經雙酶切、DNA測序鑒定；
[0009](3) DLDl穩定細胞株的構建與篩選:培養HEK-293T細胞，并接種到IOOcm的培養皿中，待細胞長到70%時，pLK0.l-puro-shPKM2重組質粒與慢病毒包裝質粒pMD2.G、psPAX2以質量比4:3:1共轉染HEK-293T細胞；培養48h、72h后分別收集含病毒的上清培養基，合并后用于感染生長狀態良好的DLDl細胞，用濃度為6 μ g/mL的puiOmycin篩選出單細胞克隆，并擴大培養，采用Real-time PCR和Western blot技術分別從mRNA和蛋白水平驗證PKM2基因的抑制效果。
[0010]實驗結果證明本發明提供的shRNA寡核苷酸序列可成功插入pLK0.l_puro表達載體中，且對PKM2基因表達的抑制效果顯著、持續且穩定。相比對照細胞，本發明得到的穩定沉默PKM2基因表達的結腸癌細胞株中谷氨酰胺代謝相關酶及受體的基因表達量均上升，說明沉默PKM2基因的表達引起了細胞谷氨酰胺的代償作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為重組質粒pLK0.l-puro-shPKM2雙酶切鑒定結果示意圖。
[0012]圖2為嘌呤霉素篩選細胞后熒光定量PCR檢測結果示意圖。
[0013]圖3為嘌呤霉素篩選細胞后Western Blot檢測結果示意圖。
[0014]圖4為穩定細胞株谷氨酰胺代謝相關酶及受體的基因表達的檢測結果示意圖。
[0015]圖5為MTT法檢測穩定細胞株谷氨酰胺的代償作 用的結果示意圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結合附圖與具體實施例對本發明做進一步說明。
[0017]實施例1
[0018](I)靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列的設計
[0019]在GenBank查找到PKM2基因的mRNA全序列(NM-001206796)，經Blast同源性比對證實特異性后應用RNA Structure4.4軟件對祀mRNA序列的二級結構進行評估，最后篩選得到一條21nt靶核苷酸序列:SEQ ID NO:5, CGGGTGAACTTTGCCATGAAT，靶點位置為946-966。
[0020]根據靶核苷酸序列設計合成一條shRNA的DNA模板單鏈，命名為shRNAl，另外再設計一對對照序列shRNAc，具體序列見表I。設計的shRNA寡核苷酸鏈由上海英駿生物技術有限公司合成。
[0021 ] 表I靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列[0022]
【權利要求】
1.一種穩定沉默PKM2基因表達的結腸癌細胞株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: Cl)根據PKM2基因的mRNA全序列，經Blast同源性比對證實特異性后應用RNAStructure4.4軟件對祀mRNA序列的二級結構進行評估得到祀核苷酸序列，設計并合成靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列:SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ; (2)將合成的shRNA寡核苷酸序列:SEQID NO:U SEQ ID NO:2等量混合，退火形成雙鏈的shRNA，同時雙酶切pLK0.1-pur ο載體，電泳，切膠回收載體，用T4DNA連接酶將雙鏈shRNA連接到載體pLK0.1-pur ο上，轉化大腸桿菌感受態，克隆擴增獲得pLK0.l-puro-shPKM2重組質粒，重組質粒經雙酶切、DNA測序鑒定； (3)培養HEK-293T細胞，并接種到培養皿中，待細胞長到70%時，pLK0.l-puro_shPKM2重組質粒與慢病毒包裝質粒PMD2.G、psPAX2以質量比4:3:1共轉染HEK-293T細胞；培養48h、72h后分別收集含病毒的上清培養基，合并后用于感染生長狀態良好的DLDl細胞，用濃度為6 μ g/mL的puromycin篩選出單細胞克隆,并擴大培養即可。
2.如權利要求1所述的方法得到的穩定沉默PKM2基因表達的結腸癌細胞株。
3.如權利要求2所述的穩定沉默PKM2基因表達的結腸癌細胞株在研究PKM2調控大腸癌細胞能量代謝、增殖、遷 移和炎癥惡性特征中的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK103451222SQ201310406638
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月9日 優先權日:2013年9月9日
【發明者】李卓玉, 武海麗, 李宗偉, 楊鵬 申請人:山西大學