使用尿嘧啶-dna-n-糖基化酶使錯誤最小化的制作方法

使用尿嘧啶-dna-n-糖基化酶使錯誤最小化的制作方法
【專利說明】使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶使錯誤最小化
[0001]本申請要求提交于2013年3月14日的美國臨時專利申請系列號61/782，698的優先權，其通過引用以其整體結合到本文中。
發明領域
[0002]本文提供涉及核酸的酶修飾的技術，和特別但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶以使由胞嘧啶殘基的脫氨作用導致的DNA序列的錯誤最小化或消除所述錯誤的方法、試劑盒和組合物。
[0003]背景
PH、溫度、離子強度、壓力等的變化經常用于分子生物學過程和測定法以引起樣品組分例如核酸、蛋白、輔因子等變化。然而，特定樣品組分(例如特定蛋白)的一些分子生物學操作對其它樣品組分(例如核酸)產生不需要的影響。例如，在分子生物學中使用熱活化的酶需要一段加熱的時間(例如，在95°C 10-20分鐘)以活化酶。在該加熱期間，存在于樣品中的核酸(例如DNA)也受到加熱。加熱核酸誘導胞嘧啶的脫氨作用(參見例如Lindahl和Nyberg (1974)^Heat-1nduced deaminat1n of cytosine residues in deoxyribonucleicacid (在脫氧核糖核酸中胞啼啶殘基的熱誘導的脫氨作用)”，B1chemistry\3(16):3405)，其導致將胞嘧啶堿基轉化成尿嘧啶堿基。而胞嘧啶堿基與鳥嘌呤配對，尿嘧啶堿基與腺嘌呤配對。因此，在互補DNA鏈的合成期間尿嘧啶堿基編碼腺嘌呤。在DNA鏈中的該起始的錯誤導致在隨后自損壞的模板合成的DNA鏈中G至A的突變和/或C至T的突變。
[0004]盡管具有2百萬個堿基的單鏈DNA分子在pH 7.4和37°C每2.8小時將經歷涉及胞嘧啶的單脫氨作用事件，但95°C孵育DNA以大約2 X 10 _7次脫氨作用事件/秒的速率誘導胞嘧啶的脫氨作用(參見例如Lindahl和Nyberg，同上)。根據該速率，在95°C加熱DNA 10分鐘以大約1個/8333個胞嘧啶引起胞嘧啶轉變為尿嘧啶。因此，該速率是意義重大的，因為分子生物學樣品經常包含超過百萬(或甚至超過十億)個胞嘧啶殘基。該轉變對于單核苷酸多態性(SNP)檢測測定是個問題，在所述測定中檢測靶向的SNP為G至A或C至T轉變。例如，在加熱活化期間大約1個/8333個拷貝野生型序列將轉變成突變體拷貝，因此產生SNP存在于樣品中的假陽性結果。因此，需要在分子生物學過程中解決核酸的熱脫氨作用的技術。
[0005]簡述
因此，本文提供涉及核酸的酶修飾的技術，和特別但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(一種“UDG”酶，通常由稱為UNG的基因編碼)以使由胞嘧啶殘基的脫氨作用(例如，由于加熱DNA導致)導致的DNA序列的錯誤最小化或消除所述錯誤的方法和組合物。在DNA分子可用作DNA合成的模板之前，尿嘧啶-DNA糖基化酶通過從DNA分子消除尿嘧啶阻止將C至U和G至A的突變固定到復制的DNA中。通過將損壞的堿基彈出雙螺旋和切割N-糖苷鍵，尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶切割連接尿嘧啶堿基與DNA骨架的N-糖苷鍵，從而除去損壞的含氮堿基和留下完整的糖-磷酸骨架。作為該過程的結果，在DNA鏈中產生脫堿基位點(亦稱為脫嘌呤/脫嘧啶位點或AP位點)。
[0006]脫堿基位點引起聚合酶停止。在一些條件下，脫堿基位點引起DNA鏈的中斷(例如，自發地和/或由于在脫堿基位點上切割核酸的酶的作用)。在任一情況下，聚合酶不繼續越過脫堿基位點，因此不引入堿基到脫堿基位點相對的互補鏈中。因此，聚合酶不產生與損壞的DNA模板互補的突變體DNA鏈，所述損壞的DNA模板由損壞的寡核苷酸引物引發導致，或因為各種分子生物學方法中的其它損壞的核酸導致。因此，損壞的堿基不引起樣品中的突變體序列的擴增。沒有該活性的情況下，在DNA合成期間自損壞的C產生的U指導聚合酶摻入A而不是G到相對互補鏈中；后續輪合成摻入T到錯誤的A的對面。結果，起始的脫氨作用事件導致將C至T和G至A的突變固定到所有后續拷貝中。C堿基的脫氨作用因此在天然群體中導致突變。
[0007]此外，在合成擴增核酸的方法(例如在聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應、引物延伸反應和其它擴增反應，如下文更詳細描述)中，C堿基經脫氨作用產生U堿基是明顯成問題的。作為實例，在PCR期間DNA的擴增按指數發生。結果，表示樣品中小比例的核酸的較少事件，例如單DNA鏈中的單C堿基的脫氨作用，被擴增和在PCR期間和在PCR的終產物中以顯著量呈現。此外，后面的PCR循環的坪效應導致在最終的擴增產物中過度呈現起始較少種類的核酸。通過PCR-相關的熱循環期間的已知誘導C堿基的脫氨作用的加熱期，這些脫氨作用問題加重。
[0008]因此，本文提供的技術涉及從DNA中識別和除去U堿基的酶。在一些實施方案中，所述酶自熱穩定的生物分離。熱穩定的酶通過許多方法產生，和熱穩定的酶的來源不限制所述技術。例如，在一些實施方案中熱穩定的酶是自嗜熱生物(例如，古細菌(Archaea)的嗜熱成員例如閃爍古生球菌(Archaeglobus fulgidis))分離的酶。
[0009]所述技術包括組合物、方法和反應混合物，其包括(或包括使用)以下酶:從DNA中識別和除去U堿基的天然熱穩定的酶，例如天然熱穩定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；從DNA中識別和除去U堿基的重組體熱穩定的酶，例如重組體熱穩定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；從DNA中識別和除去U堿基的野生型熱穩定的酶，例如野生型熱穩定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；從DNA中識別和除去U堿基的突變體熱穩定的酶，例如突變體熱穩定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；和/或從DNA中識別和除去U堿基的工程改造的熱穩定的酶，例如工程改造的熱穩定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶。
[0010]在一些實施方案中，所述酶自嗜溫生物分離和是熱穩定的酶。在一些實施方案中，熱穩定的酶通過例如隨機誘變、計算機建模、合理(定向)誘變、合理(定向)酶設計、體外進化(例如SELEX)等方法自較不熱穩定的酶產生。在一些實施方案中，所述酶是冷穩定的酶(例如，自嗜冷或喜低溫的生物分離)，其也是熱穩定的。在一些實施方案中，所述酶是尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(“UDG”或“UNG” )。
[0011]熱穩定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶是市購可得的。此外，幾種熱穩定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的核苷酸序列和/或氨基酸序列是已知的，和許多生物(包括許多嗜熱生物)的基因組序列是已知的。因此，可購買熱穩定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶，或根據已知的核苷酸和/或蛋白序列和可得的基因組序列從生物分離熱穩定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶，例如通過PCR (例如，使用靶向保守區的引物，使用簡并引物)、探針方法或通過完全體外合成。嗜熱生物區別于嗜溫生物之處在于特征例如它們的最適生長溫度(例如，高于嗜溫生物的最適生長溫度)和基因組特征(例如，更高的GC含量)。
[0012]因此，在一些實施方案中，所述技術提供與熱穩定的UDG相關的方法和組合物，所述UDG在加熱期間保持其活性，例如，在PCR的加熱步驟、測序反應的加熱步驟、樣品制備的加熱步驟期間和/或在高溫例如在60°C或更高、70°C或更高、80°C或更高、90°C或更高、或95°C或更高下孵育期間。例如，一些PCR方法使用熱活化的聚合酶例如熱活化的Taq聚合酶。經常，聚合酶保持無活性，直到在95°C或更高下加熱。在該加熱期間，發生C堿基脫氨作用。
[0013]所述技術廣泛適用于使由胞嘧啶的脫氨作用(例如由于樣品中核酸的任何加熱導致)導致的核酸序列錯誤最小化或消除所述錯誤。在用于制備樣品(例如分離和制備核酸和其它生物分子)的分子生物學技術中經常進行樣品的加熱。例如，自福爾馬林固定的石蠟包埋樣品(FFPE樣品)中制備核酸經常伴隨加熱期，其產生胞嘧啶脫氨作用和在自FFPE樣品分離的核酸序列中的相關錯誤。作為另一實例，加熱經常用于制備用于測序的核酸(例如，在制備測序文庫中)和在測序反應本身期間使用。因此，所述技術可適用于現有的測序技術和尚待開發的測序技術，例如與Sanger和Maxam測序相關的制備方法和方案、第二代(即下一代或Next-Gen)、第三代(即Next-Next-Gen)或第四代(即N3_Gen)測序技術，包括但不限于焦磷酸測序、通過連接測序、單分子測序、通過合成序列(SBS)、大規模平行克隆、大規模平行單分子SBS、大規模平行單分子實時、大規模平行單分子實時納米孔技術、使用零模式波導的方法等。Morozova和Marra在92: 255 (2008)中提供一些這樣的技術的綜述，其通過引用以其整體結合到本文中。示例性的技術是包括擴增步驟的方法，例如由Roche作為454技術平臺商業化的焦磷酸測序(例如GS 20和GSFLX)、由 Illumina 商業化的 Solexa 平臺和由 Applied B1systems 商業化的 SupportedOligonucleotide Ligat1n and Detect1n (SOLiD)平臺。亦稱為單分子測序的其它方法的實例為由Helicos B1Sciences商業化的HeliScope平臺和分別由VisiGen, OxfordNanopore Technologies Ltd.、Life Technologies/1n Torrent和Pacific B1sciences商業化的顯現中的平臺(例如納米孔測序、基于pH的核苷酸摻入事件檢測、Xpandomer技術)。
[0014]所述技術還涉及與樣品制備相關的方法，例如限制性消化、基因組擴增、片段化、末端修復、連接(例如，接頭連接)、鏈分離、二級和/或三級結構的熔解、污染物去除、蛋白去除、細胞裂解、自組織和/或細胞和/或生物流體制備核酸、附著至固體支持物、引物退火等。
[0015]所述技術還在微陣列技術、探針檢測技術(例如，印跡方法例如Southern印跡、Northern印跡、斑點印跡、槽印跡、雜交保護測定法等)中找到用途。
[0016]核酸擴增的方法經常結合樣品的加熱。核酸擴增技術的實例包括但不限于聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、轉錄介導的擴增(TMA)、連接酶鏈反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。本領域普通技術人員將認識到，某些擴增技術(例如PCR)要求在擴增前將RNA反轉錄成DNA (例如RT-PCR)，而其它擴增技術直接擴增RNA (例如TMA和NASBA)。
[0017]聚合酶鏈反應(美國專利號4，683，195,4, 683，202,4, 800，159 和 4，965，188，各自通過引用以其整體結合到本文中)，通常稱為PCR，使用多個循環的變性、引物對退火至相對鏈和引物延伸以指數增加靶核酸序列的拷貝數。在稱為RT-PCR的變化中，逆轉錄酶(RT)用于從mRNA制備互補DNA (cDNA)，和然后通過PCR擴增cDNA以產生多拷貝的DNA。對于PCR的其它各種改變，參見例如美國專利號4，683，195,4, 683，202和4，800，159 ；Mullis等，Meth.Enzymol.155: 335 (1987);和 Murakawa 等，DNA 7: 287 (1988)，各自通過引用以其整體結合到本文中。
[0018]轉錄介導的擴增(美國專利號5，480，784和5，399，491，各自通過引用以其整體結合到本文中)，通常稱為TMA，在基本恒定的溫度、離子強度和pH的條件下自動催化性合成多拷貝的靶核酸序列，其中靶序列的多個RNA拷貝自動催化產生另外的拷貝。參見例如美國專利號5，399，491和5，824，518，各自通過引用以其整體結合到本文中。在描述于美國公布號20060046265 (通過引用以其整體結合到本文中)的變化中，TMA任選結合使用封閉部分、終止部分和其它修飾部分以改進TMA過程的靈敏度和準確度。
[0019]連接酶鏈反應(Weiss, R., Science 254: 1292 (1991)，通過引用以其整體結合到本文中)，通常稱為LCR，使用與靶核酸的鄰近區域雜交的兩組互補DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在重復循環的熱變性、雜交和連接中通過DNA連接酶共價連接，以產生可檢測的雙鏈連接寡核苷酸產物。
[0020]鏈置換擴增(Walker,G.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89: 392-396(1992);美國專利號5，270，184和5，455，166，各自通過引用以其整體結合到本文中)，通常稱為SDA，使用下列的循環:將引物序列對退火至靶序列的相對鏈、在dNTPa S的存在下引物延伸以產生雙鏈體半硫代磷酸酯化的引物延伸產物、半修飾的限制性核酸內切酶識別位點的核酸內切酶介導切口和聚合酶介導的自切口的3’末端的引物延伸，以置換現有鏈和產生用于下一輪引物退火、切口和鏈置換的鏈，導致產物的幾何擴增。嗜熱SDA (tSDA)在更高的溫度下在基本相同的方法中，使用嗜熱核酸內切酶和聚合酶(歐洲專利號0 684315)。
[0021]其它擴增方法包括例如:基于核酸序列的擴增(美國專利號5，130, 238，通過引用以其整體結合到本文中)，通常稱為NASBA ;使用RNA復制酶以擴增探針分子本身的擴增方法(Lizardi等，B1Technol.6: 1197 (1988)，通過引用以其整體結合到本文中)，通常稱為QP復制酶；基于轉錄的擴增方法(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173 (1989));和自持續序列復制(Guatelli 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 87:1874 (1990)，各自通過引用以其整體結合到本文中)。對于已知擴增方法的其它論述，參見例如 Persing, David Η., Diagnostic Medical Microb1logy: Principles andApplicat1ns (診斷醫學微生物學:原理和應用)(Persing等編輯)中的“In VitroNucleic Acid Amplificat1n Techniques (體外核酸擴增技術)”，第 51-87 頁(AmericanSociety for Microb1logy, Washington, DC (1993))0
[0022]在一些實施方案中，擴增是等溫擴增方法。在一些實施方案中，擴增方法是固相擴增、polony擴增、集落(colony)擴增、乳液PCR、珠RCA、表面RCA、表面SDA等，如本領域技術人員所認識到的。在一些實施方案中，使用導致溶液中游離DNA分子擴增或通過DNA分子的僅一個末端連接至合適基質的DNA分子擴增的擴增方法。在一些實施方案中，使用依賴于橋式PCR的方法，其中兩個PCR引物連接至表面(參見例如W0 2000/018957、U.S.7，972，820、7，790，418和八(^881等，Nucleic Acids Research (2000): 28(20): E87 ;各自通過引用結合到本文中)。在一些情況下，本發明的方法可產生“聚合酶集落(colony)技術”或“polony”，其是指保持相同擴增子的空間聚類的多路擴增。這些包括例如原位polony(Mitra 和 Church, Nucleic Acid Research 27, e34, 1999 年 12 月 15 日)、原位滾環擴增(RCA) (Lizardi 等，Nature Genetics 19, 225, I"8 年 7 月)、橋式 PCR (美國專利號 5，641，658)、皮滴定(picotiter) PCR (Leamon 等，Electrophoresis 24, 3769, 2003年 11 月)和乳液 PCR (Dressman 等，PNAS 100，8817，2003 年 7 月 22 日)。
[0023]所述技術不限制于損壞(例如通過胞嘧啶的脫氨作用(例如熱誘導或其它(例如pH誘導)的胞嘧啶的脫氨作用)或摻入尿嘧啶到DNA中)和隨后暴露于從核酸中除去尿嘧啶的酶(例如UDG)的核酸的類型(例如，關于其大小、目的、來源(例如天然的或合成的)等)。例如，在一些程序中，探針、寡核苷酸、引物、接頭、基因組、擴增子、質粒或其它核酸受到損壞，例如，其包含脫氨的胞嘧啶，例如因為加熱導致。所述技術包括使因這些類型的損壞的核酸產生的錯誤最小化或消除所述錯誤。
[0024]因此，所述技術涉及熱穩定的UDG，其在活化聚合酶的高溫下孵育期間和之后(例如，在95°C下10分鐘孵育以活化Taq聚合酶)保持活性。此外，所述技術涉及熱穩定的UDG，其在PCR期間防止引物退火和鏈延伸的高溫下具有活性。具體而言，在聚合酶將腺嘌呤置于尿嘧啶對位之前，UDG從DN