雙特異性構建體及其用于治療多種疾病的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及特異性結合免疫效應細胞，同時結合IL23R攜帶性靶標細胞的雙特異 性構建體，以及核酸、載體、宿主細胞、藥物組合物及其產生和使用方法，包括所述雙特異性 構建體用于治療炎癥性和/或自身免疫疾病和/或癌癥的用途。
【背景技術】
[0002] 白介素（Interleukin，IL)-23是一種包含兩個蛋白質亞單位（根據它們的近似分 子量而指定為P40和pl9)的異二聚細胞因子。p40蛋白于IL-12與IL-23之間共用，而pl9 蛋白亞單位為IL-23所特有。IL-23通過由結合p40的IL-12受體f3-l(IL-12RM)鏈和 賦予IL-23特異性細胞內信號傳導的獨特IL-23受體鏈（IL23R)組成的雙鏈受體復合物進 行信號傳導。
[0003] IL-23誘導幼稚CD4+T細胞分化成產生病原性IL-17的輔助T (Thl7或Th1^7)細 胞。由這個獨特輔助T細胞子組分泌的IL-17是炎癥期間的一種重要效應物細胞因子。已 觀察到在各種自身免疫疾病和炎癥性病狀，包括類風濕性關節炎、炎癥性腸病（即克羅恩 氏病（Crohn' s disease)和潰瘍性結腸炎）和牛皮癬的靶標組織中，IL-17水平升高。因 此，IL-23已被暗示為炎癥性病狀和自身免疫介導的疾病中的關鍵因子。
[0004] 作為用于治療炎癥性和自身免疫疾病的潛在治療方法，迄今為止已測試若干用以 靶向IL-23/IL-17信號傳導的方法，包括針對IL-23或IL-23受體的抗體。關于使用IL-23 作為潛在藥理學干預的靶標，已開發各種針對IL-23的p40亞單位的中和抗體供潛在用于 治療自身免疫驅動的疾病。舉例來說，稱為"優特克單抗（ustekinumab) "(Janssen-Cilag) 的單克隆抗體是靶向IL-12和IL-23的共同p40亞單位的抗體。它已顯示有效治療牛皮癬 和牛皮癬性關節炎。靶向IL-23的較小pl9亞單位的另一單克隆抗體描述于EP 2548577 中。
[0005] 關于旨在通過IL-23受體靶向性抗體阻斷IL-23受體功能的策略，W02004/042009 公開使用單克隆抗IL-23受體抗體或其片段（Fv、Fab、Fab'和F(ab'）2)治療與IL-17的表 達升高相關的炎癥性疾病。此外，W02008/106134公開識別人IL-23受體的IL23R鏈，適用 于治療炎癥性和自身免疫病癥的人源化抗體的產生。這些抗IL23R抗體尤其包括可在免疫 療法中用于選擇性靶向以及殺滅在它們的表面上表達IL23R的細胞的綴合于細胞毒性有 效載荷的抗體。
[0006] -種用于基于抗體來治療各種癌癥疾病的有前途方法是，使用雙特異性抗體使免 疫效應細胞重定向以特異性溶解革巴標細胞。雙特異性抗體識別革巴標細胞的表面上的特定抗 原，同時免疫效應細胞（如自然殺傷（NK)細胞或細胞毒性T (Tc)細胞）的活化性表面分子 以由此殺滅靶標細胞。
[0007] 雙特異性抗體構思被例如用于癌癥療法中，其中采用結合癌細胞上的癌癥抗原以 及同時結合例如細胞毒性T細胞上遞呈的CD3的ε鏈的雙特異性抗體。所述雙特異性 抗體構建體的一熟知實例是用于治療非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin' s lymphoma)和 急性成淋巴細胞性白血病的作為呈BiTE(雙特異性T細胞銜接物（bi-specific T cell engager))形式的抗體的"蘭妥莫單抗（blinatumomab)"蘭妥莫單抗由Micromet開發，并 且同時結合癌癥抗原CD19以及細胞毒性T細胞的表面上的CD3,由此將這兩種細胞類型聯 系在一起，并且活化細胞毒性T細胞以溶解靶標癌細胞。
[0008] 迄今最成功的用以治療炎癥性和/或自身免疫疾病的抗體基方法利用了干擾細 胞因子和它們的相應受體的相互作用以阻止通過細胞因子受體進行信號傳導的作用機理。 實例包括抑制TNFa (例如英夫利昔單抗（infliximab)和阿達木單抗（adalimumab))、抑制 p40(例如優特克單抗）或抑制IL6R(例如托珠單抗（tocilizumab))。然而，這些抗體常仍 然允許通過多種路徑進行信號傳導。因此，很多患者不能被有效治療。舉例來說，多達40% 的患者難以用TNFa抑制性抗體治療。
[0009] 因此，在如炎癥性和/或自身免疫疾病以及癌癥的各種疾病的治療中，仍然需要 新型和改進治療策略。具體來說，要求用于所述治療的雙特異性分子是穩定的，易于生產， 對給定靶標抗原具有高度特異性，并且具有低免疫原性。
【發明內容】
[0010] 本發明通過以下方式來滿足以上提出的需要：提供特異性結合免疫效應細胞（即 細胞毒性效應T(Tc)細胞）以及同時結合IL-23受體表達性靶標細胞（例如病原性IL-17 產生性輔助T細胞（Thl7細胞））以殺滅IL-23受體表達性靶標細胞的雙特異性構建體。 [0011] 在第一方面，本發明提供一種用于治療包含IL23R表達性腫瘤細胞的癌癥的包含 至少一個第一結合部分和至少一個第二結合部分的雙特異性構建體，其中所述第一結合部 分特異性結合細胞毒性效應T(Tc)細胞上存在的第一抗原，并且所述第二結合部分特異性 結合IL-23受體特異性亞單位（IL23R)。
[0012] 在第二方面，本發明提供一種包含至少一個第一結合部分和至少一個第二結合部 分的雙特異性構建體，其中所述第一結合部分特異性結合細胞毒性效應T (Tc)細胞上存在 的第一抗原，并且所述第二結合部分特異性結合靶標細胞的表面上存在的IL-23受體特異 性亞單位（IL23R)。
[0013] 在其它方面，本發明也提供一種或多種編碼本發明的雙特異性構建體的核酸、以 及一種或多種包含所述核酸的載體和一種或多種包含所述載體的宿主細胞。
[0014] 本發明的另一方面涉及一種用于產生本發明的雙特異性構建體的方法，其包括 α)提供一種或多種本發明的核酸、或一種或多種本發明的載體，該載體表達所述核酸或所 述載體，以及從表達系統收集所述雙特異性構建體，或αυ提供一種或多種本發明的宿主 細胞，培養所述一種或多種宿主細胞，以及從細胞培養物收集雙特異性構建體。
[0015] 本發明的另一方面涉及一種包含本發明的雙特異性構建體以及藥學上可接受的 載體的藥物組合物。
[0016] 在另一方面，本發明涉及本發明的雙特異性構建體用于治療炎癥性和/或自身 免疫疾病，或在治療炎癥性和/或自身免疫疾病的方法中的用途，所述方法包括向受試者 施用有效量的本發明的雙特異性構建體。示例性炎癥性和/或自身免疫疾病包括類風濕 性關節炎、強直性脊柱炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病（Crohn' s disease)、全身性紅斑狼瘡、青少年糖尿病、自身免疫葡萄膜炎、多發性硬化癥、帕金森氏病 (Parkinsor^ s disease)、阿爾茨海默氏病（Alzheimei^ s disease)和缺血-再灌注損 傷。
[0017] 本發明的特定實施方案闡述于隨附附屬性權利要求中。
【附圖說明】
[0018] 圖I :A :IL23信號傳導和Thl抗腫瘤應答；B :提出的雙特異性抗IL23RX⑶3 ε抗 體相互作用機理；
[0019] 圖2 :IL23R在結腸癌細胞系上的表達。通過初級山羊多克隆抗IL23R抗體和PE 標記的抗山羊抗體來檢測IL23R表達。實線：IL23R表達；虛線：同種型對照。X軸，PE強 度；Y軸，細胞計數；
[0020] 圖3 :IL23R在肺腺癌細胞系上的表達。通過初級山羊多克隆抗IL23R抗體和PE 標記的抗山羊抗體來檢測IL23R表達。實線：IL23R表達；虛線：同種型對照。X軸，PE強 度；Y軸，細胞計數；
[0021] 圖4 :IL23R在淋巴瘤/白血病細胞系上的表達。通過初級山羊多克隆抗IL23R抗 體和PE標記的抗山羊抗體來檢測IL23R表達。實線：IL23R表達；虛線：同種型對照。X軸， PE強度；Y軸，細胞計數；
[0022] 圖5 :通過比對獨特⑶R集合，用COBALT的相鄰接合算法（Neighbor Joining algorithm)產生的系統發生樹；
[0023] 圖6 :通過差示掃描熒光測定法確定的PR0165的熱展開。溫度誘導的蛋白質展開 標準化熒光信號的重復測量結果；和
[0024] 圖7 :由PR0165誘導的T細胞驅動DLD-I結腸癌細胞溶解。早期凋亡和壞死DLD-I 細胞的定量；
【具體實施方式】
[0025] 在第一方面，本發明提供一種用于治療包含IL23R表達性腫瘤細胞的癌癥的包含 至少一個第一結合部分和至少一個第二結合部分的雙特異性構建體，其中所述第一結合部 分特異性結合細胞毒性效應T(Tc)細胞上存在的第一抗原，并且所述第二結合部分特異性 結合IL-23受體特異性亞單位（IL23R)。
[0026] 在本發明的含義內，術語"構建體"是指任何化學實體，只要它具有所需結合活性 即可。因此，術語"構建體"以最廣泛意義使用，并且明確涵蓋蛋白質基分子，包括包含一個 或多個抗體基結構域或其結合片段的重組抗體及其片段。特定實例包括但不限于單克隆嵌 合抗體、人源化抗體、單鏈雙功能抗體等。此外，如在本發明內例如聯合術語"構建體"使用 的術語"包含"涵蓋"包括"與"由…組成"兩者。
[0027] 如本文所用的術語"雙特異性"意指構建體具有兩種不同抗原特異性以及任選結 合它們的相應結合伴侶的其它結合部分，如結合Fc受體的部分或用于檢測和/或純化的標 簽。這意味著雙特異性構建體能夠同時結合至少一種抗原"A"和至少一種抗原"B"，其中A 和B不相同。因此，盡管具有兩種不同抗原特異性，但本發明的雙特異性構建體未必僅具有 分別針對各靶向抗原的兩個結合部分，而是也可包括超過兩個的結合部分。此外，如本文所 用的術語"抗原"應以廣義解釋，并且包括由本發明的雙特異性構建體的結合部分結合的任 何靶標部分。
[0028] 如本發明中所用，術語"特異性"或"特異性地"意指第一結合部分和第二結合部 分能夠區分它們的相應靶標分子（即區分第一抗原和第二抗原）和/或一種或多種參照分 子。因此，"特異性結合"或"特異性地結合"以它的最廣泛意義指代第一結合部分和第二結 合部分能夠區分Tc細胞的表面上的第一抗原和靶標細胞的表面上的IL23R第二抗原和/ 或與第一抗原和/或第二抗原（即IL23R)相關或不相關的其它靶標分子。
[0029] 可如本領域中所知使用例如表面等離子體共振（SPR)、蛋白質印跡（western blot)、酶聯免疫吸附測定（ELISA)、放射免疫測定（RIA或IRMA)、增強化學發光（ECL)和肽 掃描分析來測定特異性結合部分的結合特異性。
[0030] 如果使用ELISA測定，那么可借助于例如采用HRP、H202、四甲基聯苯胺系統，通過 使用辣根過氧化物酶（HRP)綴合的第二抗體進行的標準顯色反應進行評分。反應容器（例 如孔）中的在給定波長下的顯色光密度是結合特異性的量度。典型本底信號（陰性反應） 可為約0. 10D，而陽性反應的典型信號可為約1.0 OD或高于I. 00D，從而導致信噪比是10:1 或高于10:1。通常，使用一組約三種至五種無關生物分子（如奶粉、BSA、轉鐵蛋白等）而 非僅使用單一參照生物分子進行結合特異性的測定。
[0031] 具體來說，本發明涉及一種用于治療包含IL23R表達性腫瘤細胞的癌癥的方法， 其包括向受試者，特別是人患者施用有效量的本發明的雙特異性構建體。
[0032] 術語"有效量"如下所闡述在章節[0085]中定義。通常，有效量的本發明的雙特異 性構建體以上述藥物組合物的形式施用。適合施用途徑包括但不限于表面和胃腸外施用， 具體來說是皮下和靜脈內注射。不特定限制施用方案，并且包括例如歷經一周、兩周或四周 連續輸注。
[0033] 待治療的癌癥包括但不限于結腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、食道癌、 胰腺癌、B細胞淋巴瘤和T細胞淋巴瘤，包括成人T細胞淋巴瘤白血病（ATLL)、急性骨髓淋 巴瘤（AML)、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL)、濾泡性淋巴瘤（FL)、兒科急性成淋巴細胞性 淋巴瘤（B-ALL)、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤（AITL)、間變性大細胞淋巴瘤（ALCL)、T 細胞/自然殺傷細胞淋巴瘤和外周T細胞淋巴瘤（PTCL)。在特定實施方案中，癌癥選自結 腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、食道癌、B細胞淋巴瘤和T細胞淋巴瘤，如成人T 細胞淋巴瘤白血病（ATLL)、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤（AITL)、間變性大細胞淋巴瘤 (ALCL)、T細胞/自然殺傷細胞淋巴瘤和外周T細胞淋巴瘤（PTCL)。
[0034] 白介素（IL)-23與IL-12之間的平衡在調控抗腫瘤免疫應答方面起重要作用。 IL-23和IL-12是共用它們的一個結構域（p40)的異二聚細胞因子。盡管已發現由兩個 亞單位P35和p40組成的IL-12具有抗腫瘤作用，但由p40和pl9組成的IL-23似乎通過 直接作用于腫瘤細胞以及通過產生腫瘤支持性炎癥性微環境的間接機理來促進某些腫瘤 的生長。IL-12驅動對抗腫瘤免疫性至關重要的IFN-γ產生性Thl細胞的發育（Dunn，G. Ρ·等 2006. Nat. rev. Tmmunol : 6 ;836_848 !Colombo, Μ· Ρ·和 Trinchieri，G. 2002. Cytokine Growth Factor Rev; 13:155-168)。IL-12和IFN-γ