利用生殖特異性啟動子表達cre的重組酶載體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 利用Cre/loxP系統進行條件性基因敲除是目前最有效，也是最具發展前景的基 因修飾策略。在過去的30年里，以小鼠為載體，利用Cre/loxP系統進行基因功能研究取得 了非常顯著的成果。隨著轉基因技術的發展，利用Cre/loxP系統構建條件性基因敲除動物 模型將成為活體內研究基因功能的強大工具，也使得基因功能的研究更全面，更準確。
[0003] 用基因敲除技術構建的人類疾病的小鼠模型能夠很好地模仿人類疾病的發生發 展特征，為人類疾病研究提供了可靠的工具，在腫瘤研究、藥物篩選等方面應用十分廣泛。 不過，小鼠作為嚙齒類動物，與哺乳動物在基因組特點、組織結構、器官大小等方面存在比 較大的差別，因此小鼠動物模型在某些方面并不能非常準確地為人類研究提供工具。與小 鼠相比，豬作為哺乳動物，在基因組水平、器官結構大小、生理特征、代謝過程、免疫過程等 方面都與人類更接近。此外，豬發育周期短、繁殖率高、同窩產仔數多，在轉基因豬制備中， 具有較好的重復性。因此利用豬作為新的動物模型能夠為人類提供更好的研究工具。
[0004] VASA基因是DEAD-box家族中的一員，它在生殖細胞增殖和分化過程中發揮著重 要作用。因為VASA基因僅能在許多生物的生殖系細胞中才會特異性表達，所以被廣泛地 當作生殖細胞的分子標記物來使用，并且VASA基因在動物生殖細胞發生和生殖調控等方 面都起到了重要作用，并且還發現Vasa純合子突變的胚胎連生殖細胞前體細胞都無法發 育形成。VASA的基因編碼依賴于RNA解旋酶，而VASA還是DEAD - box家族中的一員。 DEAD-box家族蛋白參與和胞內RNA對細胞調控的作用有關，它們也控制著RNA本身在細胞 內的代謝。其中，調節RNA的轉錄、pre-mRNA、核內mRNA的剪切與運輸；對調控蛋白質翻譯 起始與細胞器基因表達情況還有RNA降解等過程也有著重要調控作用。DEAD - box家族所 具有的RNA解旋酶活性是完成基因復制、RNA轉錄等生命活動所必需的，并且DEAD - box 家族廣泛存在于從真、原核細菌；酵母、植物到各種高等動物，如哺乳動物等的廣大真核生 物當中。VASA基因在這些生物中保有較高的同源性。然而就魚類而言，VASA是目本前已 發現的極少數幾個在原始生殖細胞PGC中表達的分子標簽之一，在生殖腺、生殖細胞的發 育過程中起著重要的作用。VASA在果蠅的胚胎發育中起著多重的功能。除了在極細胞(原 生殖細胞）的形成中起重要作用外，它還參與果蠅胚軸后極的決定。VASA的突變不但會導 致極細胞不能形成，還可導致胚胎腹部體節的產生異常發育。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是利用VASA基因的生殖特異性表達，來建立轉基因豬模型的利用 生殖特異性啟動子表達ere的重組酶載體。
[0006] 本發明載體的構建方法是： ① VASA轉錄起始位點上游序列擴增與純化： 根據VASA轉錄起始位點上游4118 bp序列設計引物，同時分別在上下游引物5'-端引 入NheI與Seal酶切位點，以正常小型豬基因組為模板，利用Taq plus Mix擴增VASA啟動 子區片段； 引物序列如下所示： VASA-F :5，GGCTAGCCACAGATTTCAAGAGAGAAAGAAATGAGG 3， VASA-R :5' GAGTACTCCCGTTCTTCATTTGACCCAAAGTCCACC 3， PCR 反應體系包括 2 X Taq plus Mix 5ul, Primer F2/R2 各 0.5ul, Temple 0.1 yg ,H2O To 10 μ I ； ② VASA轉錄起始位點上游序列測序： 純化片段檢測后，利用T4 DNA連接酶連接到pGM-T載體，連接反應體系包括： IOXLigase Buffer Iul;回收片段 6ul ;pGM_T Vector 0.5ul;T4 DNA ligase Iul ;H2O To 10 μ I ; ③ VASA-Cre表達載體構建： 利用4300bp豬源VASA轉錄起始位點上游序列驅動Cre重組酶表達的表達載體是通過 替換實驗室保存的誘導性表達Cre重組酶載體pET28a-Mxl-Cre-BGHpolyA-FRT2neo中Mxl 序列完成的，構建載體為 pET28a-VASA-Cre-BGHpolyA-FRT2neo,基因序列 SEQ ID NO :1， 命名為：VASA-Cre，載體全長：12, 088 bp。
[0007] 本發明VASA啟動子區的組織特異性檢測：構建了 VASA-TOM質粒，將VASA的啟動 子區與紅色熒光蛋白相連接，連接成功后，將VASA-TOM瞬時轉染不同細胞系，并檢測紅色 熒光表達情況。
[0008] 本發明利用生殖特異性啟動子表達ere的重組酶載體構建轉基因豬的方法， VASA-cre質粒經過ApaLI限制性內切酶酶切線性化，DNA片段回收，轉染豬胎兒呈成纖維 細胞中進行陽性克隆篩選，將篩選出的陽性克隆細胞按常規進行受精卵去核顯微注射和輸 卵管胚胎移植。
[0009] 本發明利用生殖特異性啟動子表達ere的重組酶載體構建轉基因豬的鑒定方法， 剪取出生后4天的豬耳組織，提取基因組作為PCR模板，Cre重組酶通用引物如下，擴增目 的片段長944bp : 正向引物序列：GAATTCTCAATCGCCATCTTCCAGC 反向引物序列：AAGCTTATGGCCAATCTCCTGACCG PCR條件：預變性94°C 3分鐘；94°C變性30s ;55°C復性30s ; 72°C延伸30s，進行35 個循環；最后72 °C延伸5分鐘。
[0010] 本發明利用基因工程技術構建了一個生殖系統特異表達Cre重組酶的質粒，并且 重組質粒可以在藥物壓力下獨立于細胞染色體外存在。該質粒可以保證在生殖系統中特異 表達ere重組酶，可以與Ioxp相結合，進行相關生殖系統表達基因的敲除，為ere重組酶系 統的發展和相關基因的研究起到積極的推動作用。
【附圖說明】
[0011] 圖1是VASA基因啟動子區序列擴增； 圖2是VASA-Cre重組質粒圖； 圖3是VASA-Cre重組質粒酶切鑒定； 圖4是VASA-tdTOMATO表達載體的構建； 圖5是轉染后48 h各細胞熒光表達情況。
【具體實施方式】
[0012] 本發明載體的構建方法是： VASA轉錄起始位點上游序列擴增與VASA-Cre表達載體構建 VASA轉錄起始位點上游序列擴增與純化 根據VASA轉錄起始位點上游4118 bp序列設計引物，同時分別在上下游引物5'-端引 入NheI與Seal酶切位點，以正常小型豬基因組為模板，利用Taq plus Mix擴增VASA啟動 子區片段。引物序列如下所示： VASA-F :5，GGCTAGCCACAGATTTCAAGAGAGAAAGAAATGAGG 3， VASA-R :5' GAGTACTCCCGTTCTTCATTTGACCCAAAGTCCACC 3 PCR 反應體系包括 2 X Taq plus Mix 5ul, Primer F2/R2 各 0.5ul, Temple 0.1 yg ,H2O To 10 μ 1。將各組分混合后，按如下條件設置PCR反應程序：94°C : 5 min; 95°C : 30 s, 58°C : 30 s, 72°C : 3 min, 30 cycles; 72°C : 5 min。反應完成后 4°C保存。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120 V，30 min)。DNA Marker III作分子量標準。初步 根據分子量大小鑒定PCR產物是否正確，并利用核酸純化試劑盒純化。純化好的DNA片段 測定濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0013] 轉錄起始位點上游序列測序分析 純化片段檢測后，利用T4 DNA連接酶連接到pGM-T載體，連接反應體系包括： IOXLigase Buffer Iul;回收片段 6ul ;pGM_T Vector 0.5ul;T4 DNA ligase Iul ;H20 To 10 μL。將各組分混勻后，16°C，連接過夜。將重組質粒轉化至ToplO大腸桿菌 感受態細胞，具體操作如下：感受態細胞從_80°C冰箱取出后置于冰上，待解凍后加入10 μ 1重組質粒，輕輕混勻。將轉化體系冰浴30 min，然后42°C熱激90 s (水浴鍋），繼續冰 浴2 min。向轉化體系中加入500 μ 1液體LB培養基，37°C搖床培養40 min。取200 μ 1 轉化后的感受態細胞均勻涂布于預熱的含氨芐青霉素的固體LB培養平板上，37°C溫箱培 養過夜。過夜培養后，轉化了重組質粒的大腸桿菌在固體培養基上形成單菌落。挑取單菌 落，在含氨芐青霉素抗生素的LB液體培養基中培養過夜。過夜培養后的液體LB培養基為 含單一質粒的大腸桿菌菌液。利用質粒小提試劑盒提取質粒，做進一步鑒定。重組質粒選 擇Seal位點進行酶切鑒定。將上述組分充分混合后，37°C水浴10 min。酶切完成后，取 5 μL酶切反應體系利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120 V，30 min)。DNA Marker III作分 子量標準。初步根據分子量大小鑒定重組質粒是否正確。選擇正確的質粒樣本測序鑒定。 測序結果利用NCBI Blast分析序列是否正確，并分析是否有突變位點。選擇正確的重組質 粒（命名為pGMT-VASA)，-20°C保存，并進行下一步實驗。
[0014] 表達載體構建 本實驗中，利用4118bp豬源VASA轉錄起始位點上游序列驅動Cre重組酶表達的表 達載體是通過替換實驗室保存的誘導性表達Cre重組酶載體pET28a-Mxl-Cre-BGHpolyA-FRT2neo中Mxl序列完成的。新構建載體為pET28a-VASA-Cre-BGHpolyA-FRT2neo,命名為： VASA-Cre。載體全長：12,088 bp。
[0015] 首先，pET28a-Mxl-Cre-BGHpolyA-FRT2neo 表達載體與 pGM-T -VASA 重組質粒利 用Nhel/Scal雙酶切，反應體系如表1. 6所示：
將上述組分充分混合后，37°C水浴30 min。酶切完成后，將酶切反應體系進行1%瓊脂 糖凝膠電泳，并利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應片段。利用T4 DNA連接酶將VASA啟動 子區序列回收片段連接到回收的表達載體相應位點。連接反應體系如表包括=IOXLigase Buffer Iul ;VASA 回收片段 5ul ;表達載體片段 2ul ;T4 DNA Ligase Iul ;H20 To 10 μ1〇 將上述組分充分混合后，16°C，連接過夜。連接產物轉化至ToplO大腸桿菌感受態細胞，并 均勻涂布于預熱的含卡那霉素的固體LB培養平