快速檢測鮑魚養殖環境中高致病病原微生物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及鮑魚養殖，具體涉及快速檢測鮑魚養殖環境中高致病病原微生物的方 法。
【背景技術】
[0002] 鮑魚肉質鮮美，營養豐富，其由于富各種含氨基酸、維生素及人體必需的多種微量 元素和礦物質，被譽為海味八珍之冠。除了營養外，近代醫學家也認為鮑魚有滋補強壯之 效，有溫補肝腎、益精明目、滋陰清熱、可明目和降血壓，故鮑魚即是豐盛宴席上的美味，也 是食物療法中佳肴，同時有研究表明從鮑魚提取的多糖具有很好的抗腫瘤、提高免疫力等 作用。鮑殼是著名的中藥"石決明"，有平肝潛陽，清肝明目的功效，是治療高血壓，頭昏、肝 硬化的良藥，臨床上常用其代替羚羊角。
[0003] 20世紀中期鮑魚的自然捕獲量每年僅有200至200噸，70年代廣東省進行鮑魚的人 工養殖和幼苗實驗并獲得成功，80年代作為重點推廣性生產，開始被逐步推廣，近幾年來， 隨著鮑魚養殖技術的日趨成熟，我國鮑魚的人工養殖發展速度驚人，人工養殖的規模不斷 擴大，已經成為世界大型的鮑魚養殖國。
[0004] 隨著鮑魚養殖規模的不斷擴大，密集養殖程度日益增強，養殖環境的逐步惡化，各 種病害頻繁發生，如膿鮑病、"掉板癥"等，導致許多養鮑場嚴重虧損甚至倒閉，成為制約鮑 魚養殖業進一步發展的重要制約因素，其中，病原微生物被認為是導致養殖鮑魚高死亡率 的重要因素鮑魚養殖遇到的各種病害，如大連地區1993年夏季發生了河流弧菌引起皺紋盤 鮑的"膿鮑病"；2000年東山縣爆發性流行鮑病由溶藻弧菌和副溶血弧菌共同作用導致； 2006年周晶等人研究發現溶藻弧菌是導致南方雜色鮑幼苗大規模死亡(業內稱之為"掉板 癥"）的致病菌;2011年王智等人從九孔鮑苗病體上分離出的病原菌為溶藻弧菌。
[0005] 結合以往的報道和研究發現，鮑魚細菌性疾病多數由溶藻弧菌、副溶血弧菌和河 流弧菌引起，而且，有些細菌如副溶血弧菌還可以導致人類的疾病。因此，如何快速檢測鮑 魚養殖環境中的高致病病原微生物對于鮑魚的人工養殖具有重要的意義。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是如何快速檢測鮑魚養殖環境中的高致病病原微生 物的問題。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是提供一種快速檢測鮑魚養殖 環境中高致病病原微生物的方法，包括以下步驟：
[0008] 確定鮑魚養殖環境中存在治病風險且需及時處理，以及無治病風險需但進一步監 測的菌限值；
[0009] 收集鮑魚養殖環境水樣，并提取所收集水樣中全部病原菌DNA;
[0010]利用溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種特定引物對樣品中病原菌的總DNA進 行熒光定量PCR測定，獲得所收集水樣中是否存在上述三種病原菌或者病原菌總量是否超 過設定的菌限值，以此判斷所收集水樣是否存在病原微生物的威脅。
[0011] 在上述方法中，用于檢測溶藻弧菌的引物為：
[0012] F-引物，5-GTCGGATTCAAGAGTCGGTATT-3;
[0013] R-引物，5-TAACCCGCGCGTAAGTATAAG-3;
[0014] 片斷長度Amplicon Length = 136bp;
[0015] 解鏈溫度Tm = 60;
[0016] 用于檢測河流弧菌的引物為：
[0017] F-引物，5-CTCAAGCCATCTCAACCCTAC-3;
[0018] R-引物，5-CGGTCGCGATCAACTGATAA-3;
[0019] 片斷長度Amplicon Length = 102bp;
[0020] 解鏈溫度Tm = 60;
[0021] 用于檢測副溶血弧菌的引物為：
[0022] F-引物，5-CTGATAACTTGCCGGACGATAC-3;
[0023] R-引物，5-GTTTGCCACGCGAATGTAATC-3;
[0024] 片斷長度Amplicon Length = 101bp;
[0025] 解鏈溫度Tm = 60。
[0026] 在上述方法中，利用鮑魚在養殖環境中細菌半數致死量的測定結果，確定鮑魚養 殖環境中存在治病風險且需及時處理，以及無治病風險需但進一步監測的菌限值。
[0027]
[0028]在上述方法中，提取水樣中全部微生物的DNA的方法如下：
[0029] 使用10um無菌濾膜將收集到的鮑魚養殖環境的水樣過濾，去除固體雜質及真菌， 再利用〇 · 22um無菌濾膜過濾水樣，把水樣中的細菌微生物全部固定在0 · 22um濾膜上；
[0030] 收集0.22um濾膜，用無菌剪刀剪碎置放入50ml無菌離心管中，添加生理鹽水，充分 振蕩，然后收集濾膜上的微生物；
[0031 ]反復凍融及溶菌酶溶解細胞壁，并利用SDS和蛋白酶K變性蛋白質破壞細胞膜，利 用CTAB除掉多糖，最后通過酚/氯仿/異戊醇抽得到樣本微生物總DNA，室溫干燥后溶于30yL 去離子水中，并置于_20°C備用。
[0032]在上述方法中，對樣品中病原菌的總DNA進行熒光定量PCR測定的具體方法如下： [0033]將獲得的溶解DNA作為模板，選用溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種病原菌特 定引物進行熒光定量PCR擴增；
[0034] PCR反應體系如下：
[0035] 8 · 5ul蒸饋水，SYBR Green Realtime PCR Master 12 · 5ul，濃度50ng/ul的引物各 lul，濃度50ng/yL的2yL DNA模板共25ul;
[0036] PCR反應條件為94°C預變性lmin，94°C變性30s，60°C退火30min，72°C延伸30s，循 環40次，最后72°C延伸補平5min終止反應。72°C到95°C，每升高0.5°C檢測一次熒光信號，繪 制溶解曲線，測得三種病原菌的含量。
[0037] 在上述方法中，針對熒光定量PCR測定結果，采取的措施如下：
[0038]測定結果顯示水樣中不存在溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種病原菌，則無 需消毒處理；
[0039] 測定結果顯示水樣中的溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種病原菌中的任一種 超過菌限值，存在對鮑魚有治病風險，則需及時消毒處理；
[0040] 測定結果顯示水樣中的溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種病原菌中的任一種 超過菌限值，但對鮑魚無治病風險，則需進一步監測。
[0041] 本發明，針對三種致病病原菌設計特異引物，熒光定量PCR結果可以直接反應該致 病菌，無需向16sRNA序列分析方法那樣需要測序進行比對，更節省時間，從養殖場取樣到得 出結果只需四小時。使得，養殖廠可快速在疾病發病前期做出正確處理，避免鮑魚受到該三 種病原菌病害，減少損失。養殖廠也可在致病菌剛剛出現期向鮑魚養殖水樣中添加益生菌， 抑制致病菌的生長，維持水樣中微生物系統的穩定，減少消毒劑或者抗生素的使用，避免養 殖中環境污染，為低碳養殖、生態養殖打下基礎。
【附圖說明】
[0042]圖1為本發明的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0043] 本發明提供了一種快速檢測鮑魚養殖環境中高致病病原微生物的方法，從養殖場 取樣到得出結果只需四小時，能迅速對水樣中是否存在三種治病病進行定量檢測，養殖廠 可根據檢測結果快速做出判斷，在鮑魚發病前期做出正確處理，可保護鮑魚養殖廠免受三 種病原菌的災害，減少損失。養殖廠也可在致病菌剛剛出現時向鮑魚養殖水樣中添加益生 菌，抑制致病菌的生長，維持水樣中微生物系統的穩定，減少消毒劑或者抗生素的使用，避 免養殖中環境污染，為低碳養殖、生態養殖打下基礎。下面結合說明書附圖和【具體實施方式】 對本發明做出詳細的說明。
[0044] 如圖1所示，本發明提供的快速檢測鮑魚養殖環境中高致病病原微生物的方法，包 括以下步驟：
[0045] 步驟10 :利用鮑魚在養殖環境中細菌半數致死量的測定結果，確定鮑魚養殖環境 中存在治病風險且需及時處理，以及無治病風險需但進一步監測的菌限值；
[0046] 其中的一種具體實施例如下：
[0047]分別將三種細菌涂布于2216E海水固體培養基(上海哈靈生物科技有限公司生產 銷售)上，25°C恒溫培養24小時；
[0048]用無菌人工海水將上述三種細菌的菌苔洗滌下來，制成菌懸液，加入到1L滅菌海 水的燒瓶中，并分別調整菌體為濃度為l〇3CFU/ml、104CFU/ml、105CFU/ml和106CFU/ml四 種，放入相應的1L燒瓶中。
[0049] 其中，CFU表不菌落形成單位(Colony-Forming Units)。
[0050] 剪取藻膜上的鮑魚(皺紋盤鮑），連同藻膜用無菌海水沖洗5次，然后分別放入上述 不同菌體濃度的燒杯中，每種濃度共設平行樣4個，實驗過程中保持溫度為25°C，不添換海 水，不另外加飼料，觀察鮑魚病變死亡情況。
[0051 ] 觀察時，分別于24h、48h和72h觀察鮑魚活動情況，計算致死率。用Reed Muench法 分別計算24h、和72h的半致死量(LD5Q)。本實施例中，皺紋盤鮑三種致病菌感染半致死量如 下：
[0052]
[0053] 以三種致病菌感染半致死量分別作為鮑魚養殖環境的每種病菌的菌限值，當水樣 中溶藻弧菌超過2.1 X 104CFU/mL、河流弧菌超過7.0 X 104CFU/mL、副溶血弧菌限度超過4.5 X 104CFU/mL時，必須在24小時內進行相應的消毒處理。同樣，超過上表中72小時的菌限值 時，必須在72小時內進行相應的消毒處理。否則，會引起鮑魚死亡。
[0054]步驟20:利用無菌容器收集鮑魚養殖環境的水樣，并使用10um濾膜去除水樣中的 雜質及真菌；
[0055]步驟30:利用0.22um濾膜過濾截留水樣中的全部微生物；
[0056]步驟40:利用DNA提取方法，提取水樣中全部微生物的DNA;
[0057] 步驟20-40的具體實施例如下：
[0058]使用10um無菌濾膜將收集到的鮑魚養殖環境的水樣過濾，去除固體雜質及真菌， 再更換0 · 22um無菌濾膜過濾水樣，把水樣中的細菌微生物全部固定在0 · 22um濾膜上；
[0059]收集0.22um濾膜，用無菌剪刀剪碎置放入50ml無菌離心管中，添加生理鹽水，充分 振蕩