一種耗牛foxo3基因單核苷酸多態性的檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[00011本發明涉及基因多態性檢測技術領域，具體涉及一種耗牛F0X03基因單核苷酸多 態性的檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] F0X03是F〇x(forkhead box)蛋白家族的一個重要成員，與細胞轉化、腫瘤的發生 發展及其血管生成有關。針對F0X03基因研究已成為當今研究熱點。對F0X03基因進行定性 分析有助于對F0X03基因的進一步研究。
[0003] 單核苷酸多態性(SNP)是基因組中發生頻率最高的變異種類。目前數據庫內的SNP 數量已經超過了 9000000個，人體的許多表型差異，以及對藥物或疾病的易感性等，都可能 與SNP有關。研究SNP可促進人們對基因組結構、基因的進化歷史及疾病發生根源的了解。 SNP是種群遺傳分析、疾病發生機理和藥物研發等領域的重要研究對象。目前，針對SNP研究 所建立的數據庫和高效、精確、方便操作的工具，對于展現SNP在引領遺傳分析、疾病診治等 領域發展方面的重要性具有很高的利用價值。
[0004] 單核苷酸多態性（8；[即161111(31601:1(16口0150]1〇印11-18111，3即)是指相同或不同物種個 體的基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸存在差別的現象。其中多態性 (polymorphism)指的是形態多樣性和狀態多樣性，在這里是基因水平上的多態性，指一個 基因座位上存在多個等位基因，它是基因組中發生頻率最高的點突變，在已知DNA的多態性 中占了大約90 %。同時，也發現每1000個堿基中就有一個會發生變異，它在一個種群中的發 生率至少在1 %水平。因此，具體地說，SNP指的是基因組序列中單核苷酸(A、T、C和G)改變時 所發生的DNA序列的多態性變化，即基因組內特定的核苷酸位置上存在2種或更多不同的堿 基，其中最少一種在群體中的頻率不低于1 %。
[0005] 多態性(SNP)位點的經典方法是一大類以凝膠電泳為基礎的一系列傳統方法，包 括:限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)，此方法應用的前提是SNP位點必須含有限制性內 切酶的識別位點，但此方法是SNP位點篩查中最經典的方法之一;單鏈構象多態性法(PCR-SSCP)，該方法簡單快速，被廣泛運用與未知基因突變的檢測，但這種方法對溫度要求嚴格 且不能確定突變的類型及突變的具體位置，因而帶有一定的盲目性。變性梯度凝膠電泳 (DGGE)，多用于分析自然環境中細菌類和、真核生物和病毒等生物的多樣性。此方法具有可 重復和操作簡單等特點，但此法會受到DNA分子互補鏈中氫鍵的含量的影響，因此很少用于 SNP位點的檢測分析;等位基因特異性PCR法(ASPCR)。
[0006] 而現有的一些新型SNPs高通量檢測方法包括:高效液相色譜法(DHPLC)法;基因芯 片法及DNA直接測序法。其中DHPLC法檢測效率高便于自動化的優點，且準確率高，但DHPLC 對所用試劑和環境要求高，易產生誤差。基因芯片法具有信息量大、自動化程度高的特點， 但芯片造價成本昂貴，所需設備貴重，所以不利于普及應用。而DNA直接測序法突變位點檢 出率高、速度快，擺脫了傳統的凝膠電泳所對溫度的要求，且對其類型和位置分析準確，帶 有目的性，成本相對低，利于廣泛應用于檢測SNP位點。
[0007] 目前現有技術中針對F0X03基因遺傳變異的研究較少，該基因位點的功能研究及 其遺傳變異與經濟性狀關聯的研究仍是空白，且現有針對F0X03基因單核苷酸多態性的檢 測多存在探針與目標序列存在錯配堿基的問題，這樣，就會大大減少探針與目標序列結合 的緊密度，影響探針的熒光釋放量，導致檢測結果不準確。由此可見能否提供一種耗牛 F0X03基因單核苷酸多態性的檢測方法及其試劑盒，有效實現耗牛F0X03基因單核苷酸多態 性的檢測，且具有靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢測等優點，成為本領域技術 人員亟待解決的技術問題。
【發明內容】
[0008] 本發明為了解決上述技術問題，提供一種耗牛F0X03基因單核苷酸多態性的檢測 方法及其試劑盒，該方法及其試劑盒具有檢測靈敏度高、特異性好、成本低、快速、高通量檢 測等優點。
[0009] 為了達到上述技術效果，本發明包括以下技術方案：
[0010] 一種耗牛F0X03基因單核苷酸多態性的檢測方法，包括以下步驟：
[0011] 步驟一：制備牦牛F0X03基因擴增產物：首先提取耗牛血液基因組DNA，將其稀釋 后，以基因組DNA為模版，以牦牛F0X03基因序列設計特異性引物對1、特異性引物對2、特異 性引物對3和特異性引物對4，PCR擴增耗牛F0X03基因，得到PCR擴增產物后純化，取純化后 PCR擴增產物測序，根據測序結果鑒定牦牛F0X03基因，找出單核苷酸位點；
[0012] 步驟二:合成高低溫內標:通過高分辨率熔解曲線分析耗牛F0X03基因單核苷酸多 態位點的DNA探針，進行基因型分析，合成高低溫內標，并對熔解曲線進行校正，所述耗牛 F0X03基因單核苷酸多態位點的DNA探針包括針對F0X03基因 98077A/G位點的探針、針對 F0X03基因 98109A/G位點的探針、針對F0X03基因 98109G/C位點的探針；
[0013] 步驟三：制備HRM-PCR擴增產物：取F0X03基因的基因組DNA，加入步驟二所述的耗 牛F0X03基因單核苷酸多態位點的DNA探針，進行HRM-PCR擴增，得到HRM-PCR擴增產物；
[0014]步驟四：收集熒光信號:將步驟二合成的高低溫內標稀釋，并與步驟三制備的HRM-PCR擴增產物混合，于高分辨率熔解曲線分析系統中收集熒光信號，通過不同的熒光檢測結 果確定檢測SNP位點處堿基突變的基因型。
[0015]進一步的，所述特異性引物對1為：
[0016] 上游引物：5' CTCCAGACAAACGGCTCACT 3';
[0017] 下游引物：5' CCCAACACCTACCCACCC 3';
[0018]所述特異性引物對2為：
[0019] 上游引物：5/0：01^^1'(^0^6八八丁八3/;
[0020] 下游引物：5' CCGCAATGGTCCAACTGA 3';
[0021]所述特異性引物對3為：
[0022] 上游引物：5' TGACGGTGGGAAGAGTGG 3';
[0023] 下游引物：5' CGCTGTGGCTGAGTGAGT 3';
[0024]所述特異性引物對4為：
[0025]
[0026] 下游引物：5' TGGTGGAGCAAGTTCTGATT 3'。
[0027]進一步的，所述特異性引物對1擴增長度為157bp，其擴增位置為1242-1398;所述 特異性引物對2擴增長度為196bp，其擴增位置為97148-97343;所述特異性引物對3擴增長 度為734bp，其擴增位置為97467-98200;所述特異性引物對4擴增長度為890bp，其擴增位置 為97471-98360。
[0028] 進一步的，所述PCR擴增的反應程序為:95°C預變性3min，94°C變性30s，復性30s， 特異性引物對1的PCR擴增退火溫度為56°C，特異性引物對2的PCR擴增退火溫度為59°C，特 異性引物對3的PCR擴增退火溫度為58°C，特異性引物對4的PCR擴增退火溫度為59°C，72°C 延伸30s，35個循環，72°C延伸lOmin，4°C保存。
[0029] 進一步的，所述步驟二中的耗牛F0X03基因單核苷酸多態位點的DNA探針核苷酸序 列為：
[0030] 針對F0X03基因98077A/G位點的上游探針：
[0031] 57 GCAGGTGCTGTTCCAGAT 37 ；
[0032] 針對F0X03基因98077A/G位點的下游探針：
[0033] 57 GGGGAGGTCTTCTATTCTGT 37 ；
[0034] 針對F0X03基因98109A/G位點的上游探針：
[0035] 57 TGAAATCCCACTGACTTT 37 ；
[0036] 針對F0X03基因98109G/C位點的下游探針：
[0037] 57 GGCAATCACCAACTGTAT 37 ；
[0038] 針對F0X03基因98226G/C位點的上游探針：
[0039] 57 AGACAGCAGCAGGCAATA 37 ；
[0040] 針對F0X03基因98226A/G位點的下游探針：
[0041 ] 57 CACATCTGGAACAGCACC 37 〇
[0042] 進一步的，所述步驟三的HRM-PCR擴增的反應程序為：95°C預變性5min，94°C變性 20s，復性20S退火溫度54~59°C，72°C延伸20s，35個循環，72°C延伸5min，4°C保存。
[0043] 進一步的，所述步驟四中的高低溫內標稀釋的方法包括以下步驟:10D內標單鏈加 400yL水，退火體系為:飽和氯化鈉 lyL，內標互補雙鏈各lyL，補水至10yL，95°C水浴3min，溫 度降至室溫，得到稀釋后的高低溫內標。
[0044] 進一步的，所述高低溫內標的核苷酸序列為：
[0045]退火溫度為57°C的低溫I內標：
[0046] 57 GTATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTAAATTTAA-C3-37 ；
[0047]退火溫度為53°C的低溫II內標：
[0048] 57 TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATAC-C3-37 ；
[0049]退火溫度為86°C的高溫I內標：
[0050] 5'GCCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3-3 7 ；
[00511退火溫度為86°C的高溫II內標：
[0052] 5'GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGGC-C3-3 7 〇
[0053] 進一步的，所述步驟四中的收集熒光信號的步驟包括:將稀釋好的高低溫內標各1 yL，加入HRM-PCR擴增產物單孔中，于95°C水浴30s; 25°C水浴30s;放入高分辨率熔解曲線分 析系統