基于離子束介導技術構建重組大腸桿菌生產輔酶i的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于離子束生物技術和分子生物學領域，具體涉及離子束介導基因生產輔 酶I方法。
【背景技術】
[0002] 在酶的六大類型中，有百分之三十左右是氧化還原酶，氧化還原酶在在制藥、食 品、精細化工、農藥等領域具有重要的用途，它的應用也越來越受到人們的重視，而大部分 氧化還原酶催化作用的發揮需要煙酰型輔酶的參與，輔酶I在生物氧化過程中起遞氫作用， 活化各種酶系統，促進核酸、蛋白質、多糖的合成及代謝，增加物質轉運和調節控制，改善代 謝功能。NAD+和NADH的價格昂貴，通常比酶促反應所得產物要貴得多，每克輔酶I大約要700 元左右，由于氧化還原酶應用廣泛而輔酶價格昂貴，使得輔酶工業化生產逐漸成為研究熱 點。
[0003] 1986年，受離子注入材料表面改性研究的啟發，中國科學院等離子體物理研究所 與安徽省農科院水稻所合作將低能離子注入應用于水稻的品種改良，獲得極大的成功。隨 后離子注入被用于微生物和農作物的基因組改良，大量研究表明低能離子與生物體之間具 有動量傳遞、能量沉積、粒子注入和電荷交換的過程。離子束介導是通過一定劑量和能量的 離子束對細胞壁的濺射作用在破壞細胞壁或細胞膜上產生微孔通道，促進外源遺傳物質進 入細胞;其次，用于注入的帶正離子降低了細胞表面的負電性，從而減弱了對帶負電的外源 DNA的排斥力，從而促進了外源DNA的吸附和進入。再者，離子束可以直接和間接的打斷細胞 內的雙鏈DNA，以便外源DNA的整合和重組。
[0004] 眾所周知，很多疾病的起因大多是因為體內糖、脂肪和蛋白質代謝不良而引起，而 輔酶I是參與體內乙酰化反應、氧化還原反應和能量代謝的關鍵輔酶，對體內糖、脂肪和蛋 白質代謝起重要作用。如何強化上述糖、脂肪和蛋白質代謝已成為藥物研發主攻方向之一。
[0005] 現在國內外主要通過提取法、發酵法、生物合成法、強化法、和有機合成法等方法 制備輔酶I。國內一直利用離子交換樹脂從酵母中生產輔酶I，但是產品得率和純度較低，雖 然工藝成熟，但是耗費大量能源和材料，以及原料的昂貴，使得輔酶I的生產和后續產品研 發收到了極大限制，大腸桿菌因培養條件簡單、遺傳背景清楚、生長快、發酵周期短、等諸多 優點，在基因工程領域成為使用最廣泛的宿主菌，基因工程菌株大量表達合成原本在野生 菌株中不能或微量表達的蛋白和不能合成的有機化學品。而實現產品的工業化生產與成熟 的重組菌發酵工藝是緊密相關，不可逾越的，因此實現基因工程技術和工程菌的發酵工藝 的有機結合，無疑會為重組產品實現大規模生產奠定基礎。
[0006] 盡管許多微生物在自然狀態下都能產輔酶I，但絕大多數的輔酶產量極低，而通過 常規育種技術耗時費力，難以篩選到產輔酶I的高產菌株，這就造成了生產成本居高不下， 限制了其工業化生產。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是提供一種基于離子束介導技術構建重組大腸桿菌生 產輔酶I的方法，以克服現有技術的不足，提供一種新的輔酶I生產技術，可大幅提高發酵液 中輔酶I的含量，其含量可以穩定在l〇g/L。
[0008]為了達到上述目的，本發明采用的技術方案為： 一種基于離子束介導技術構建重組大腸桿菌生產輔酶I的方法，包括如下步驟： 1)將煙酰胺核苷激酶基因，連接到載體上，構建表達載體； a) 將步驟1)的表達載體通過低能離子束介導技術導入大腸桿菌； b) 利用選擇性培養基進行重復篩選，獲得可以高效表達煙酰胺核苷激酶的重組大腸桿 菌； c) 將重組大腸桿菌接種到發酵培養基中發酵生產輔酶I。
[0009]步驟1)所述煙酰胺核苷激酶基因為羅伯茨綠僵菌（Metarhiziumrobertsii)ARSEF23的NRK基因片段MAA_05394,所述載體為pet28a。
[0010] 步驟2)中離子束介導的能量為14~18KeV，劑量(80~200)X1014ions/cm2,靶室真空 度為（1.0~2.0)X10_3Pa。優選為離子束介導的能量為18KeV，劑量170X1014ions/cm2,靶室 真空度為1.6X10-3Pa。
[0011]步驟3)選擇性培養基是在LB培養基中加入50ug/ml的卡那霉素。
[0012]步驟4)中發酵培養基包含按質量百分比的如下組分:碳源2-6%、氮源0.5-1%，無 機鹽0.01-0.1%，生長因子0.1-0.4%，余量為水，pH=7.0-7.2，其中碳源為葡萄糖、蔗糖和甘 油中的至少一種;氮源為酵母膏、玉米漿、蛋白胨和氯化銨中的至少一種;無機鹽為氯化鈉、 硫酸鎂、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉中的至少一種;生長因子為腺嘌呤或煙酰胺中的至少一 種。
[0013] 步驟4)中發酵采用高密度發酵，接種量為1-5%(V/V)，發酵培養的溫度為28-34°C， 搖床轉速為200_250r/min。接種后檢測0D在0.6-0.8時加入終濃度為0.5mMIPTG誘導培養 12-16h后加入終濃度為0.2-0.5%表面活性劑，繼續培養4-8h。其中表面活性劑為十二烷基 苯磺酸鈉、十四烷基苯磺酸鈉和十六烷基苯磺酸鈉中的一種。
[0014] 有益效果： 本發明將煙酰胺核苷激酶基因基因片段，經分子生物學手段構建表達載體，通過離子 束介導方法將表達載體導入大腸桿菌，得到遺傳穩定性良好的高產輔酶I的重組大腸桿菌， 可以大幅提高發酵過程中輔酶I的含量;相對于傳統技術，由于離子束射程的可控性和可聚 束的特點，可精確控制被刻蝕受體表面形成轉基因通道的直徑和深度，有利于外源基因轉 移、整合和表達而且離子束的濺射屬于冷加工范疇，與傳統轉到技術相比，加工精度高，可 以不傷及鄰近組織和細胞器。
[0015]本發明所導入的煙酰胺核苷激酶可以高效的將底物腺嘌呤和煙酰胺轉化成產物 輔酶I，在發酵后期添加陰離子表面活性劑，可以將胞內的輔酶I泄露到細胞外，這樣可以省 去傳統方法中需要使用昂貴破壁設備，大大節約了生產成本，易于后期的分離提取。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施實例對本發明做進一步描述，可以更好地理解本發明。然而，本 領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說 明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0017]實施例1本實施例說明基于離子束介導技術構建重組大腸桿菌的方法 1、設計合成帶有EcoR頂每切位點的上游引物和帶有BamHI酶切位點的下游引物(下 劃線部分為相應的酶切位點）， Primer1 上游引物：5'-CGGAATTCATGCCCAAATCCCTCATAATAGG-3' ； Primer2下游引物：5'-CGGGATTCCTATGGGTGCTTCCTCAGTT-3'〇
[0018] 2、以MetarhiziumrobertsiiARSEF23基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因片段 MAA_05394(GeneID: 19259680)，反應條件為：95°C，5min; (95°C30s，60°C60s，72°C 1.5min，30個循環）；72°C，10min。純化擴增出的MAA_05394基因（參照TakaraDNA片段純化 試劑盒說明書)和克隆質粒pet28a(購自Takara公司）分別用EcoRI和bamHI雙酶切、連接轉 化至DH5a感受態細胞(購自Takara公司），使用EcoRI和bamHI雙酶切鑒定重組質粒pet28a-phzM，得到大小為1000bp左右的條帶，酶切結果表明，重組質粒pet28a_phzM構建成功，獲 得重組質粒pet28a_phzM。
[0019] 3、將步驟2)的表達載體通過低能離子束介導技術導入大腸桿菌:取已培養好的大 腸桿菌BL21用無菌水制成濃度大約為1X106個/mL孢子懸浮液;取100yL孢子懸浮液加入 50yL步驟2)構建的重組質粒pet28a-phzM，均勾涂布到無菌空平板上，以無菌風吹干，在能 量為18Kev，注入劑量為170X1014ions/cm2，靶室真空度為1.6X10_3Pa進行氮離子注入介 導，注入完畢后，在無菌環境下用lml無菌水進行洗脫;取洗脫液50yL在無菌條件下均勻涂 布到加入50ug/ml的卡那霉素平板培養基上，在37°C下培養12-24小時，即可獲得重組大腸 桿菌。
[0020] 實施例2 從實施例1選擇性培養基上挑取三個單菌落，分別記為S1~S3,其形態學及生理化學特 性： 菌落形態:光滑、圓潤、有光澤、乳白色、圓形或橢圓形；需氧方式:異養兼性厭氧型；菌 落大小：0.5~3μπι;生長溫度:28-37°C;最適pH為7.0-7.2;菌落形態:短桿;革蘭氏染色為 陰性。
[0021 ]傳代發酵試驗結果見表1 表1重組大腸桿菌的遺傳穩定性
從遺傳穩定性實驗結果分析可知，經過6次傳代試驗，重組大腸桿菌發酵產輔酶I基本