一株高效轉化延胡索酸為l-天冬酰胺的重組大腸桿菌及其構建方法與應用
【專利摘要】本發明公開了一株能夠高效轉化延胡索酸為L?天冬酰胺的重組大腸桿菌，將耐銨型大腸桿菌BEW308中編碼富馬酸酶的基因fumA、fumB、fumC失活，再將編碼L?天冬氨酸酶和L?天冬酰胺酶編碼基因插入到編碼富馬酸酶fumAC基因的位置，即得到無蘋果酸副產、少量L?天冬氨酸積累并主產L?天冬酰胺的重組大腸桿菌。本發明還公開了上述菌株的構建方法及應用。本發明可實現L?天冬氨酸酶和L?天冬酰胺酶的組成型高活性表達，并最終實現延胡索酸至L?天冬酰胺的轉化。
【專利說明】
-株高效轉化延胡索酸為L-天冬醜胺的重組大腸桿菌及其構 建方法與應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體設及一株轉化延胡索酸合成k天冬酷胺生產 菌株及其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002] k天冬酷胺是k天冬氨酸的徑基酷胺化合物，在醫藥、食品、輕化工和水環保方面 具有廣泛的用途，在醫藥行業主要作為氨基酸輸液中的二十種之一，并具有治療皮膚病的 功效。在食品行業只要作為營養增補劑，抗酒精中毒劑，也可進一步衍生做香味劑。在化工 行業主要做鐵鹽的穩定劑及陶瓷表面的薄膜。在環保行業是水處理膜的重要原料。
[0003] 目前k天冬酷胺的生產主要天冬氨酸為原料經醋化氨解，精制而成，但其過 程產物收率偏低，且設及大量的有機溶劑，污染大，廢水難處理。生物法具有反應溫和、轉化 率高、S廢易處理等優點，是k天冬酷胺最佳的生產方式，但k天冬氨酸轉化為心天冬酷胺 過程中設及到輔酶的參與，因此需要解決輔酶的供給問題，本發明基于此構建了具有高效 轉化合成心天冬酷胺的菌株，并建立了其發酵工藝，生產指標具有顯著的經濟性。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是，提供一株利用延胡索酸合成心天冬酷胺的重組大腸 桿困。
[0005] 本發明還要解決的技術問題是，提供上述能夠高效轉化延胡索酸合成心天冬酷胺 重組大腸桿菌在制備k天冬酷胺中的應用。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：
[0007] 一株高效轉化延胡索酸為-天冬酷胺的重組大腸桿菌，將耐錠型大腸桿菌邸W308 中編碼富馬酸酶的基因化減、化1118、化1]1(：失活，再將編碼心天冬氨酸酶基因和編碼心天冬酷 氨酶基因插入到編碼富馬酸酶的fumAC基因位置，即得高效轉化延胡索酸為-天冬酷胺的重 組大腸桿菌。所述的耐錠型大腸桿菌BEW308,該菌株的保藏號為CCTCC N0:M2013157,該菌 株的詳細信息已經在申請號為201310279778.6的中國專利中公開。
[000引其中，所述編碼k天冬氨酸酶的基因序列如SEQ ID NO: 1所示，所述編碼k天冬酷 胺酶的基因序列如SEQ ID N0:2所示。
[0009] 其中，1^-天冬氨酸酶基因的起始密碼子上游有一段信號膚，該信號膚的基因序列 如SEQ ID N0:3所示，將k天冬氨酸酶基因的終止密碼子刪除，在心天冬氨酸酶基因的末端 與心天冬酷氨酶基因之間有一段連接序列，該連接序列如SEQ ID N0:4所示。
[0010] 上述高效轉化延胡索酸為天冬酷胺的重組大腸桿菌的制備方法，其特征在于，包 括如下步驟：
[00川 （1)將PKD46質粒轉入耐錠型大腸桿菌BEW308中，篩選出陽性轉化子大腸桿菌 BEW308-地D46，利用k阿拉伯糖誘導其表達A重組酶，再將大腸桿菌肥W308-P邸46制備成感 受態細胞；
[001^ (2似PIJ773質粒為模板，沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6所示的序列為引物，PCR擴 增得到fumB基因敲除片段；
[001引（3)將步驟(2)得到的化mB基因敲除片段電轉化至大腸桿菌肥W308-PKD46制備成 感受態細胞中，在安普抗性平板上篩選陽性重組子；
[0014] (4)將步驟(3)得到的陽性重組子制備成感受態細胞，將PCP20質粒轉化其中，42°C 誘導FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在物抗性的平 板上生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株為化mB基因失活的菌株邸W308- A fumB;
[0015] (5)合成同源重組片段:在SEQ ID NO: 1起始密碼子ATG前增加信號膚序列SEQ ID NO: 3，刪除心天冬氨酸酶基因的終止密碼子，并在k天冬氨酸酶基因后添加連接序列SEQ ID N0:4,該片段還包括安普霉素抗性基因序列，并在該片段的兩端添加了fumAC的同源臂， 具體序列如SEQ ID NO:7所示；
[0016] (6)將步驟(4)得到的化mB基因失活的菌株邸W308-A化mB制備成感受態細胞，將 PKD46質粒轉化其中，利用k阿拉伯糖誘導其表達A重組酶，再將其制備成感受態細胞；
[0017] (7)將步驟巧）中的同源重組片段轉化至步驟(6)的含有A重組酶的感受態細胞中， 在安普抗性平板上篩選陽性重組子；
[001引（8)將步驟(7)中的陽性重組子制備成感受態細胞，將PCP20質粒轉化其中，42 °C誘 導化P重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在無抗性的平板 上生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株即為能夠高效轉化延胡索酸為天冬 酷胺的重組大腸桿菌邸W308 A fumB-AfumAC-aspC2-30-asnA。
[0019] 上述轉化延胡索酸為-天冬酷胺的重組大腸桿菌在生產k天冬酷胺中的應用。
[0020] 其中，其發酵過程分為誘導階段和轉化階段。
[0021] 其中，誘導階段培養基配方為:延胡索酸20g/L，酵母粉24g/L，蛋白腺10g/L，K2HP化 36mmol/L，MgS〇4 lOmmol/L，微量元素 [CaCl2.6H20 0.74g/L，ZnS04.7H20 0.18g/L， MnS04.出0 20g/L，Na2-EDTA20.1g/l，CuS04 Q.lg/L，CoCl2 0.104g/L，FeS04.7此02g/L]2mL/ U溶劑為水，抑為7.2~7.5。
[0022] 轉化階段補料發酵:誘導階段結束后分次補加總計葡萄糖40~60g/L，延胡索酸 150~200g/L。
[0023] 其中，誘導階段溫度為28~30°C，pH為7.2~7.8,溶氧為5~40%;轉化階段溫度為 30~37°(：，口出％7.2~7.8，溶氧為5~40%。
[0024] 其中，葡萄糖補加方式為將葡萄糖配置成600g/L的儲液，并根據發酵液體積分兩 次補加，總計40~60g/l;延胡索酸的補加方式為配成400g/L的延胡索酸混懸液，并用氨水 調節抑至中性，分5次補加總計約150~200g/L的延胡索酸。
[00巧]有益效果：
[00%] (1)本發明可實現k天冬氨酸酶和k天冬酷胺酶的組成型高活性表達，且發酵培 養后獲得的細胞具有低富馬酸酶活性。
[0027] (2)通過誘導-轉化兩階段發酵過程，其轉化產物中主要是心天冬酷胺(底物的摩 爾轉化率超過97.5%)，有少量k天冬氨酸積累，無蘋果酸積累。該方法可有效提高底物延 胡索酸的轉化收率，降低副產物的生產，有效降低生產成本。
【附圖說明】
[002引圖1敲除fumB基因的線性片段PCR圖，泳道M為marker,泳道1為線性片段。
[00巧]圖2菌落PCR鑒定圖，其中邸W308泳道為出發菌株，M為Markera~8為鑒定的單菌 落。
【具體實施方式】
[0030] 根據下述實施例，可W更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0031] 實施例1:
[0032] 本實施例說明利用同源重組技術敲除親本耐錠型大腸桿菌BEW308中富馬酸酶 fumB基因，得到消除安普霉素抗性菌株的過程。
[0033] (1)利用LB培養基，于37°C、有氧條件下培養大腸桿菌邸W308至ODsoo = O. 4~0.6， 制備成電轉感受態；
[0034] (2)將地D46質粒電轉入感受態的大腸桿菌邸W308。電擊條件為:200 Q，2扣F，電擊 電壓2.3kv，電擊時間4~5ms。電擊后迅速將菌體加入預冷1血的SOC培養基，150r/min、30°C 培養化之后涂布于帶氨節青霉素(amp)的LB培養基平板篩選出陽性轉化子BEW308(地D46);
[0035] (3)在LB培養基中加入1〇11^的心阿拉伯糖，于30°C下誘導質粒地D46表達出A重組 酶，制成電轉感受態；
[0036] (4) W兩側帶有FRT位點的安普霉素抗性基因為模板，利用高保真PCR擴增系統，W 質粒PIJ773為模板，并設計兩端帶有化mB同源片段的擴增引物，擴增出線性DNA同源片段， 引物序列如下：
[0037] 上游帶同源臂引物Hl-Pl(沈Q ID N0:5):
[0038] 5' -0GGCA0GCCATTTT0GAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTC0GGGGATC0GT0GACC-3'
[0039] 下游帶同源臂引物肥-P2(沈Q ID N0:6):
[0040] 5 ' -TTACTTAGTGCAGTT0G0GCACTGTTTGTTGA0GATTTGCTGGMGMTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，
[0041 ] 反應體系：帶同源臂的上下游引物（1 OOpmo 1 Ai 1)各0.化1;模板DNA (1 OOng/山）0.5 y 1; 10 X buf f er 5山；dNTPs (IOmM)各化1; DMS0( 100 % ) 2.5iU ; Pyrobest DNA聚合酶（2.5U/ii I)化I; dd肥0 36/35.化1;總體積50iU。
[0042] 反應條件:94°C，2min; (94°C，45sec;50°C，45sec;72°C，90sec;10個循環）；（94°C， 45sec;55°C，45sec;72°C，90sec;15個循環）；72°C，5min。
[0043] 線性DNA片段的鑒定如圖I。
[0044] (5)電轉線性DNA片段至已誘導表達A重組酶的邸W308(地D46)感受態，并涂布于帶 安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進行了 PCR鑒定，電泳圖如圖2所示。
[0045] (6)陽性重組子制備成感受態后倒入能誘導表達化P重組酶的質粒PCP20,于42°C 熱激表達化P重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗 性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌即為已經敲除抗性的菌株，命名為邸W308( A fumB)。
[0046] 實施例2:本實施例考察了突變Escherichia coli 1(12的^天冬氨酸酶基因 (aspC)后對該酶活性的影響。具體操作過程為：W原始的aspC為基礎，將236和249位氨基酸 進行突變化ys236Asn，Gly249Thr)，通過人工合成的方式合成該基因，命名為aspC2。將突變 的基因連接到pTrc99a表達質粒并導入邸W308( A fumB)，構建獲得邸W308( A fumB，aspC2)， W為突變的重組菌BEW308( A fumB，aspC)作對比，結果如表1:
[0047] 表1天冬氨酸酶突變前后的酶學性質變化情況 [004引 L0049」實施例3:
[0050] 本實施例說明利用同源重組技術進一步敲除大腸桿菌BEW308( A化mB)中富馬酸 酶fumAC基因，并引入突變的高活性心天冬氨酸酶和k天冬酷胺酶基因。
[0051] 整個實驗操作過程與實施例1 一致，僅同源序列不同。
[0052] (1)本實施例WEscherichia COli 1(12的1^-天冬氨酸酶基因（aspC)為出發序列， 同時236和249位氨基酸進行突變獲得aspC2,即Lys236Asn，Gly24OThr，同時在啟始密碼子 ATP上游增加了一段信號膚序列：atgttgaatccgaaggttgcc1:acatggtctggatgacgtgcctgggtt taacgttgcccagccaggca(SEQ ID ^:3所示），下游刪除了終止密碼子；所述編碼心天冬酷胺 酶基因（asnA)，其起始密碼子與心天冬氨酸酶基因末端基因之間有一段30bp的連接序列W 確保兩個酶同時具有高活性，該30bp序列為CAATCTGGACCGTGGCATCCTGGAAGCATT(SEQ ID NO: 4所示）。
[0053]最終在兩端增加 fumAC的同源臂和安普霉素抗性基因序列，整段基因采用人工合 成的方式合成，具體核巧酸序列見SEQ ID N0:5所示。
[0化4] (2)電轉人工合成的線性DNA片段至已誘導表達A重組酶的邸W308( A fumB,PKD46) 感受態，并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進行了 PCR鑒定，陽性重組子 制備成感受態后倒入能誘導表達化P重組酶的質粒PCP20,于42°C熱激表達化P重組酶后即 可消除安普霉素抗性。利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在 抗性平板上生長的菌即為已經敲除抗性的菌株，命名為邸W308( AfumB-A^mAC-aspCS- SO-asnA)
[0化5] 實施例4:
[0056] 本實施例對比考察了出發菌株Escherichia COli邸W308和重組菌Escherichia CO 1 i BEW308 ( A化mB- A化mAC-aspC2-30-asnA)在發酵培養基中誘導培養化后的富馬酸 酶、天冬氨酸酶、心天冬酷胺酶活性的對比數據。
[0057] W及邸W308( A化mB- A fumAC-aspC2-30-asnA)兩步法合成k天冬酷胺的過程數 據。
[005引具體步驟和結果如下：
[0059] (1)采用LB培養基，按1~2% (v/v)接種量從凍存管接入S角瓶中，有氧培養10~ 12h，進一步按1~2% (v/v)接種量接種至搖瓶或者種子發酵罐(培養基也為LB)，種子培養 過程溫度控制在30°C，培養中不需調節抑，溶氧控制在5~40%，培養4~化后待菌體ODsoo至 2.5~4之間，按5~10%接種發酵培養基的誘導培養基，發酵過程溫度控制在3(TC，培養過 程抑用氨水控制在7.2~7.8，溶氧控制在5~40 %，培養化。
[0060] 表2 Escherichia COli BEW308( AfumB-A fumAC-aspC2-30-asnA)與出發菌株酶 活比較
[0061]
[0062] (2)誘導之后添加30g/L葡萄糖和150g/L延胡索酸(用氨水調節至中性后分S次補 加），提高溫度至37°C進入轉化階段，收集轉化12h，16h，20h和24h的菌液產物分析。實驗結 果見表2。
[0063] 表3 Escherichia coli BEW308( A fumB-A fumAC-aspC2-3〇-asnA)發酵液過程
[0064]
【主權項】
1. 一株高效轉化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌，其特征在于，將耐銨型大腸桿 菌BEW308中編碼富馬酸酶的fumA、fumB、fumC基因失活，再將編碼L-天冬氨酸酶的基因和編 碼L-天冬酰氨酶的基因插入到編碼富馬酸酶的fumAC基因位置，即得高效轉化延胡索酸為-天冬酰胺的重組大腸桿菌。2. 根據權利要求1所述的高效轉化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌，其特征在于， 編碼L-天冬氨酸酶的基因序列如SEQ ID NO: 1所示，編碼L-天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO:2所示。3. 根據權利要求1所述的高效轉化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌，其特征在于， 編碼L-天冬氨酸酶的基因的起始密碼子上游有一段信號肽，該信號肽的基因序列如SEQ ID NO: 3所示，將L-天冬氨酸酶基因的終止密碼子刪除，在L-天冬氨酸酶基因的末端與L-天冬 酰氨酶基因之間有一段插入連接序列，該連接序列如SEQ ID N0:4所示。4. 權利要求1所述的高效轉化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌的制備方法，其特 征在于，包括如下步驟： (1) 將PKD46質粒轉入耐銨型大腸桿菌BEW308中，篩選出陽性轉化子大腸桿菌BEW308-PKD46,利用L-阿拉伯糖誘導其表達λ重組酶，再將大腸桿菌BEW308-pKD46制備成感受態細 胞； (2) 以pIJ773質粒為模板，SEQ ID Ν0:5和SEQ ID Ν0:6所示的序列為引物，PCR擴增得 到fumB基因敲除片段； (3) 將步驟(2)得到的fumB基因敲除片段電轉化至大腸桿菌BEW308-pKD46制備成感受 態細胞中，在安普抗性平板上篩選陽性重組子； (4) 將步驟(3)得到的陽性重組子制備成感受態細胞，將pCP20質粒轉化其中，42°C誘導 FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在物抗性的平板上 生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株為fumB基因失活的菌株BEW308-A fumB； (5) 合成同源重組片段:在SEQ ID NO: 1起始密碼子ATG前增加信號肽序列SEQ ID NO: 3,刪除L-天冬氨酸酶基因的終止密碼子，并在L-天冬氨酸酶基因后添加連接序列SEQ ID N0:4,該片段還包括安普霉素抗性基因序列，并在該片段的兩端添加了fumAC的同源臂，具 體序列如SEQ ID NO:7所示； (6) 將步驟(4)得到的f umB基因失活的菌株BEW308-Af umB制備成感受態細胞，將pKD46 質粒轉化其中，利用L-阿拉伯糖誘導其表達λ重組酶，再將其制備成感受態細胞； (7) 將步驟(5)中的同源重組片段轉化至步驟(6)的含有λ重組酶的感受態細胞中，在安 普抗性平板上篩選陽性重組子； (8) 將步驟(7)中的陽性重組子制備成感受態細胞，將pCP20質粒轉化其中，42°C誘導 FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在無抗性的平板上 生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株即為能夠高效轉化延胡索酸為天冬酰 胺的重組大腸桿菌 BEW308AfumB-AfumAC-aspC2-30-asnA。5. 權利要求1所述的轉化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌在制備L-天冬酰胺中的 應用。6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，其發酵過程分為誘導階段和轉化階段。7. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，誘導階段培養基配方為:延胡索酸20g/L， 酵母粉24g/L，蛋白胨10g/L，K 2HP〇4 36mmol/L，MgS〇4 10mmol/L，微量元素[CaCl2.6H20 0.74g/L,ZnS04.7H20 0.18g/L,MnSO4.H2O 20g/L,Na2-EDTA 20.lg/L,CuSO4 O.lg/L,CoCl2 0 · 104g/L，FeS〇4· 7H20 2g/L]2mL/L，溶劑為水，pH為7 · 2~7 · 5。 轉化階段補料發酵:誘導階段結束后分次補加總計葡萄糖40~60g/L，延胡索酸150~ 200g/L〇8. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，誘導階段溫度為28~30°C，pH為7.2~7.8， 溶氧為5~40 % ;轉化階段溫度為30~37 °C，pH為7.2~7.8，溶氧為5~40 %。9. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，葡萄糖補加方式為將葡萄糖配置成600g/L 的儲液，并根據發酵液體積分兩次補加，總計40~60g/L;延胡索酸的補加方式為配成400g/ L的延胡索酸混懸液，并用氨水調節pH至中性，分5次補加總計約150~200g/L的延胡索酸。
【文檔編號】C12N1/21GK105925520SQ201610430229
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月16日
【發明人】馬江鋒, 姜岷, 董維亮, 章文明, 陳可泉, 吳昊
【申請人】南京工業大學