腎祖細胞的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及腎發育。更具體地，本發明涉及從人多能干細胞生產腎單位祖細胞和 最終生產輸尿管祖細胞的體外方法。
【背景技術】
[0002] 由于全球晚期腎病的患病率上升至8%1，迫切需要腎再生策略。腎是通過輸尿管 芽(UB)的形成以及該芽與鄰近的頂-衍生的后腎間充質(麗)之間的相互作用而從間介中胚 層(頂)分化出的中胚層器官 2。腎單位源自從MM衍生出的腎單位祖細胞群3。頂本身從后原條 衍生出4。盡管腎的發育起源被較好地理解 2,然而人腎中的腎單位形成在出生之前完成5。因 此，不存在能夠替代喪失的腎單位的出生后干細胞。
[0003] 人多能干細胞對于基于細胞的腎臟疾病治療的產生而言具有巨大潛力。但是，關 于如何生產所述必需細胞類型（其產生腎單位和腎的其它結構）的理解的缺乏，已經阻礙作 為臨床用細胞的來源和作為諸如腎臟疾病的治療劑的人多能干細胞的實現。
【發明內容】
[0004] 本發明的發明人已經使用正常胚胎發生過程中所用的生長因子在完全化學成分 確定的單層培養條件下成功地指導人多能干細胞穿過后原條和間介中胚層（頂)的分化。該 分化方案導致輸尿管芽(UB)和后腎間充質(MM)的同步誘導，所述后腎間充質(MM)在體外形 成自組織結構，包括腎單位形成。這樣的hESC-衍生的組分表現出廣闊的離體腎潛力，從而 證實基于多能干細胞的腎再生的潛力。
[0005] 因此，本發明的一個方面提供了一種生產腎單位祖細胞和輸尿管上皮祖細胞的方 法，所述方法包括以下步驟:使間介中胚層（IM)細胞與以下物質接觸:成纖維細胞生長因子 9(FGF9)和/或成纖維細胞生長因子20(FGF20);和任選的一種或多種選自以下的試劑:骨形 態形成蛋白7 (BMP7);肝素;Wnt激動劑;視黃酸(RA)、類似物或激動劑;和RA拮抗劑；以由此 從所述頂細胞生產腎單位祖細胞和輸尿管上皮祖細胞。
[0006] 在一個實施方案中，所述IM細胞是從后原條細胞衍生出或分化出。
[0007] 在一個實施方案中，所述后原條細胞是從人多能干細胞(hPSC)衍生出或分化出。 hPSC的非限制性例子包括人胚胎干細胞(hESC)和誘導的人多能干細胞(iPSC)。
[0008] 在一種優選形式中，該方面提供了一種方法，其包括以下相繼步驟：
[0009] (i)使hPSC與促進hPSC分化成后原條細胞的一種或多種試劑接觸；
[0010] (ii)使所述后原條細胞與促進后原條細胞分化成IM細胞的一種或多種試劑接觸； 和
[0011] (iii)使IM細胞與FGF9接觸，所述FGF9是單獨的或與以下一種或多種組合:BMP7; RA; RA拮抗劑;Wnt激動劑;和/或FGF20;和肝素；以由此從所述頂細胞生產腎單位祖細胞和 輸尿管上皮祖細胞。
[0012] 在步驟（ii)處的一種或多種試劑優選地包括FGF9。在一個特定實施方案中，FGF9 存在于步驟（ii)和（iii)的至少一部分或完全貫穿其中。在一個特別優選的實施方案中， Wnt激動劑諸如CHIR99021存在于步驟（i)中。
[0013] 在一個實施方案中，所述方法進一步包括鑒別存活的腎單位祖細胞和/或輸尿管 上皮祖細胞的步驟。
[0014] 在某些實施方案中，鑒別存活的腎單位祖細胞和/或輸尿管上皮祖細胞包括，測量 或檢測作為存活的腎單位和/或輸尿管上皮祖細胞的標志物的多種核酸和/或蛋白的共表 達。
[0015] 在另一個方面，本發明提供了根據前述方面的方法生產的分離的、富集的或純化 的腎單位和/或輸尿管上皮祖細胞。
[0016] 在另一個方面，本發明提供了一種生產腎或腎細胞或組織的方法，所述方法包括 以下步驟:從前述方面的腎單位祖細胞和/或輸尿管上皮祖細胞分化出腎或腎細胞或組織， 以由此生產所述腎或腎細胞或組織。
[0017] 在某些實施方案中，所述腎單位祖細胞和/或輸尿管上皮祖細胞可以用作生物打 印或生物工程改造全腎和腎組織的來源，所述全腎和腎組織用于腎移植或治療慢性腎臟疾 病。
[0018] 在其它實施方案中，所述腎單位祖細胞和/或輸尿管上皮祖細胞可以用于整個器 官去細胞化的腎的重新細胞化，以由此建立重構的或替代性的腎。
[0019] 在其它實施方案中，所述腎單位祖細胞和/或輸尿管上皮祖細胞可以用作腎疾病 和病況的細胞療法的來源。
[0020] 在另一個方面，本發明提供了一種確定一種或多種化合物的腎毒性的方法，所述 方法包括以下步驟:使所述一種或多種化合物與前述方面的分離的或純化的腎單位祖細胞 和/或輸尿管上皮祖細胞或從其分化出或以其它方式得到的腎細胞或組織接觸，以由此確 定所述一種或多種化合物是否是腎毒性的。
[0021] 在一個實施方案中，該方面提供了將腎單位祖細胞和/或輸尿管上皮祖細胞生物 打印成用于腎毒性篩查的腎類器官。
【附圖說明】
[0022] 圖1.后原條和間介中胚層從人胚胎干細胞的連續分化.a，從內細胞團至腎譜系的 發育階段的示意圖。在每個階段中顯示的基因代表該階段的特異性標志物。b，FACS分析 (GFP和前向散射(FSC))顯示了在3天培養以后用不同比例的BMP4/激活素 A(ng/mL)或8μΜ CHIR99021誘導的MIXL1-GFP陽性的后原條細胞的百分比。hESC，開始細胞;無 GF，用基礎培 養基培養3天。c，d，對于通過qRT-PCR分析評估的BMP4和激活素 A(ng/mL)的每種比例， S0X17、BRACHYURY(T)和MIXLl在第3天時的相對表達(c)。不同濃度的CHIR99021的相同qRT-PCR分析(d)。誤差棒是標準差(n = 3個實驗he，從hESC至頂使用的分化方案的示意圖。f，在 第6天時的1^〇?，顯示了從第2天至第6天在有或沒有200叫/1111?6?9存在下頂的標志物 (?八乂2丄^1、031?1)的表達。 8，從第2天至第6天在有或沒有200即/1111?6?9存在下在第6天時 PAX2蛋白陽性的細胞的百分比的定量。經由BMP4/激活素 A(B/A)和CHIR99021(CHIR)的兩個 分化方案超過了 80%誘導效率。誤差棒是標準差(n = 5個場，共來自3個實驗hh，使用BMP4/ 激活素 A(B/A)或CHIR99021(CHIR)經由后原條誘導在第6天時PAX2(紅色）和LHXl (綠色）蛋 白的存在和共表達（比例尺=100μπι)。i，qRT-PCR顯示了從第2天至第6天整個FGF9的濃度梯 度在第6天時頂(？4乂2、^^1)、？1〇8乂6)和1^1$(^?1)的標志物的表達。誤差棒是標準差(11 =3個實驗）。j，qRT-PCR顯示了從第2天至第6天在有FGF9以及NOG或BMP4存在下在第6天時 中胚層標志物的表達變化。誤差棒是標準差(n = 3個實驗）Λ，在第6天時的IF，顯示了用 ΡΑΧ2 (紅色)標記的主要頂群體和用ΤΒΧ6 (綠色)標記的不重疊的PM(比例尺=1 ΟΟμπι)。
[0023]圖2.后原條誘導.a,用ΒΜΡ4/激活素 A(30/10ng/ml)誘導以后多能標志物0CT4和 NANOG的時程定量RT-PCR，顯示了多能基因表達隨時間的減小。誤差棒是標準差(η = 3個實 驗hb，在使用CHIR99021進行后原條誘導之前(hESC)和之后(第2天），ES細胞標志物NANOG 和ECAD的IF(比例尺=10(^)。〇，在使用0111?99021進行后原條誘導之后(第2天），后原條的 標志物T和MIXLl (GFP)的IF。將MIXLl檢測為由MIXLl內源性啟動子驅動的GFP表達（比例尺 =100^1〇。(1，如果用3種不同比例的BMP4和激活素 A(ng/mL)，在培養以后隨時間誘導的自發 OSRl表達的水平。用3種不同比例的BMP4和激活素 A 3天，hESC形成胚狀體，然后在無生長因 子條件下自發地分化至第14天。這證實了在用高BMP4和低激活素 A(30/10)誘導的細胞中改 善的OSRl表達。OSRl標記了IM和LPM。
[0024]圖3.FGF信號傳遞對IM蛋白的誘導的影響.a，在有或沒有FGF信號傳遞抑制劑 PD173074存在下從第2天至第6天用BMP4/激活素 A(至第2天）和FGF2(200ng/ml)、FGF8 (200ng/ml)、FGF9(200ng/ml)或無生長因子(無 GF)處理第6天時hESC培養物上的PAX2蛋白 的IF(比例尺=20(^11〇。13,在與IF(a)相同的方案的第6天，檢查PAX2、LHX1和OSRl的相對表 達水平的定量RT-PCR。帶陰影的柱顯示了 FGF抑制劑17 3074的添加的影響。誤差棒是標準 差(n = 3個實驗）。〇，在用BMP4/激活素 A(+FGF9(B/A))或8μΜ CHIR99021(+FGF9(CHIR))處理 至第2天、隨后從第2天至第6天用200ng/mL FGF9或無生長因子(無 GF)處理的第6天時hESC 培養物上的頂標志物PAX2以及LPM和頂二者的標志物OSRl的IF。僅第二抗體對照用作陰性 對照（僅2°413)(比例尺=10(^111)。(1，該表顯示了在用8以1〇111?99021處理至2天、隨后從第2 天至第6天用200ng/mL FGF9處理的第6天完全PAX2-和PAX2+細胞（全部）或與LHX1-和LHXl + 細胞一起在hESC培養物上的百分比。誤差是標準差(n = 5個場，共來自3個實驗）。
[0025] 圖4.BMP信號傳遞對早期中胚層的外側-內側模式形成的影響。a，從第2天至第6天 用或不用BMP4(5或50ng/mL)或BMP拮抗劑N0G(25或250ng/mL)在有200ng/mL FGF9存在下在 第6天時DAPI (藍色)和PAX2(紅色）的IF(比例尺=20(^111)。13，研究該81^/勵6梯度在第6天時 對PM (PARAXIS和TBX6)和LPM (FOXF1和OSRl)標志物的表達的影響的qRT-PCR。誤差棒是標準 差(n = 3個實驗）。
[0026] 圖5.說明在早期腎發育階段中不同祖細胞群和衍生細胞群體的預期基因表達的 示意圖。PS，原條;IM，間介中胚層;MM，后腎間充質;NP，腎單位祖細胞/腎發生間充質;RV，腎 囊泡;DT，遠曲小管;PT，近曲小管;PocU足細胞;ND，輸尿管;UB，輸尿管芽/輸尿管上皮;CD， 集尿管;MET，間質至上皮轉變。所有基因用斜體指示。帶陰影的框指示鄰近的經標記的基因 的表達的時機和持續時間。在每個細胞類型旁邊指示具體基因標記DT、PT和Pod。已知發生 在UB和NP之間的分化的相互誘導，被來自UB的FGF9(腎發生間充質存活）和Wnt9b(MET)，和 來自NP的GDNF(輸尿管分支）的表達支持。
[0027] 圖6.來自體外hES細胞的輸尿管祖細胞和后腎祖細胞的逐步時間誘導。a，用于誘 導腎發育的最初的hESC指導的分化方案(BMP4:激活素 A/FGF9/FGF9: BMP7: RA)的示意圖。在 線下面的數字指示分化的天數。b，基因從第O天至第17天的時程RT-PCR，代表了分化成腎的 每個階段。這些包括后原條(MIXL1、LHX1)、頂(LHXl、PAX2、0SR1)、MM(0SR1、SIX2、WT1 ·⑶NF、 HOXDl I)和UE(PAX2、CRET、H0XB7)的基因。包括PAX6以確保不存在外胚層定型的證據。NC，沒 有DNA模板的陰性對照。c，從第6天至第17天的時程IF，顯示了 PAX2 (紅色）和ECAD (綠色)雙 陽性的上皮結構（上圖）和包圍這些上皮結構的WTl (紅色）陽性群體（下圖）的形成（比例尺 =20(^)。(1，在定向分化時程中存在于hESC培養物內的WTl+或SIX2+細胞的比例的定量。這 些蛋白的共表達標記了 MM/腎單位祖細胞(NP)群體，而WTl蛋白也在隨后分化的腎單位中表 達。誤差棒是標準差(n = 3個實驗he,分化的第14天揭示了 MM(ECAD-SIX2+)在ECAD+UE周圍 的存在（比例尺= 用于誘導腎發育的替代性的hESC定向分化方案(CHIR99021/ FGF9)的示意圖。在線下面的數字指示分化的天數。g，經由使用CHIR99021/FGF9的分化從第 0天至第18天的時程RT-PCR，代表了在(b)中指示的分化成腎的每個階段。h，關于在(c)中指 定的蛋白，經由使用CHIR99021/FGF9的分化從第0天至第18天的時程IF(比例尺= 200μπι)。 i，使用CHIR99021/FGF9分化以后在(d)中描述的定量。誤差棒是標準差(η = 5個場，共來自3 個實驗）。j，在第14天包圍ECAD+UE結構的S1X2+濃縮的間充質細胞的存在（比例尺=1 ΟΟμπι)。 k，在第17天時的IF顯微術，顯示了在第17天時鄰近PAX2+GATA311M的區域的PAX2+GATA3+UE (比例尺=5〇μπ〇。
[0028]圖7 . RA對輸尿管上皮形成的積極作用。a，在分化的第12天時的EdU摻入測定。 30min的EdU暴露揭示，不僅PAX2+前上皮結構、而且PAX2陰性細胞正在增殖中。白色箭頭指 示PAX2+細胞中的EdU摻入（比例尺=100μπι) A，在使用BMP4/激活素 A的后原條誘導以后第6 天時的IM細胞，其用FGF9與不同的RA濃度一起培養11天。UE標志物PAX2+ECAD+的IF表明，以 RA劑量依賴性的方式誘導UE結構（比例尺=20(^111)。(3,使用BMP4:激活素 A/FGF9/FGF9: BMP7: RA方案在分化的第22天時的RT-PCR揭示了指示分化成成熟腎細胞類型的基因的表 達，所述基因包括SYNP0、NPHS1和WTl (對于足細胞）；AQP2和SCNNBU對于遠端小管或集尿 管），以及AQPl和SLC3A1 (對于近端小管）AC，沒有DNA模板的陰性對照。g，使用BMP4/激活素 A的第22天分化的IF，顯示了兩種關鍵足細胞標志物的共表達:裂孔隔膜蛋白SYNPO(綠色） 和細胞核WTl (紅色）。細胞核也被DAPI (藍色)染色（比例尺=50μπι)。
[0029]圖8.CHIR99021/FGF9指導的分化以后腎潛力的評估和hESC的腎單位誘導的證據。 a，使用CHIR99021/FGF9至第6天的最初誘導、隨后用FGF9(與不同的RA濃度一起或不用生長 因子(無 GF))的另外5天以后，在分化的第12天時hESC-衍生的細胞。PAX2和ECAD蛋白的IF表 明，以RA劑量依賴性的方式誘導UE結構（比例尺=20(^111)。13，主要腎標志物(31乂2、!1(^11、 H0XB7、F0XD1)、多能標志物(0CT4)和生殖腺/腎上腺皮質標志物（S0X9、SFl、GATA6)的qRT-PCR。將使用BMP4/激活素 A(B/A)或CHIR99021(CHIR)方案在分化的第18天時的基因表達水 平相對于GAPDH歸一化，然后與未分化的hESC中的水平對比。使用人胎兒腎RNA作為陽性對 照。誤差棒是標準差(η = 3個實驗）。c，IF表明，在誘導的第12天，一些WTl+MM細胞(紅色）也 是HOXDll +(綠色）AOXDll是后腎區域的一種特異性標志物，所述后腎區域包括MM和腎間質 (H0XD11+WT1-)(比例尺=20(^11〇。(1，使用WTl (紅色）的相位差和IF，分化（CHIR99021/FGF9) 的第18天以后培養物的低放大率視野。WTl +間充質的簇包圍UE，正如在胚胎腎中可見到的 (比例尺=20(^111)。6，111+和SIX2+間充質（紅色）在第18天緊密地包圍ECAD+UE(綠色）（比例 尺=50μπι) J，在第18天的IF共焦顯微術顯示PAX2+ECAD+UE被早期腎單位/RV包圍，正如通過 JAGl和⑶H6的存在所評估的。被虛線包圍的區域是PAX2+GATA3+ECAD+UE結構。用方括號指示 的區域放大在右側鄰近圖中（比例尺=25μηι)(放大的比例尺=ΙΟμπι)。
[0030] 圖9.Η9 hES細胞系和iPS細胞系朝向腎譜系的分化。
[0031] a，b,在H9 hESC(a)和CRL2429 Cll iPS細胞（b)上的DAPI(藍色）、PAX2(紅色）或 SIX2(紅色)在分化的第6天和第14天的免疫熒光(比例尺= 200μπι)。
[0032] 圖10.hESC-衍生的腎祖細胞向小鼠腎細胞的重新聚集體中的摻入。a，腎潛力的重 新聚集測定的示意圖。將胚胎第12.5-13.5天小鼠腎解離成單個細胞，并與第12-13天的 hESC-衍生的誘導腎細胞組合，沉淀在過濾膜上，并在空氣-培養基界面處培養4天。hESC-衍 生的細胞與小鼠腎細胞的比例是4-96。b，使用組成性地表達GFP的未分化hESC (ENVY細胞 系)作為陰性對照的重新聚集測定，顯示了未分化的hESC-衍生的大囊腔(cyst)形成(綠色） (比例尺=200μπι)。c，分化第13天，hESC-衍生的小鼠 E12.5-13.5腎細胞的重新聚集測定。通 過人線粒體抗體(HuMt)或人細胞核抗體(HuNu)(綠色），檢測所有摻入的hES細胞-衍生的細 胞。白色箭頭指示在小鼠腎結構中摻入的人細胞。PAX2+和CALB