2-脫氧青蟹肌糖還原酶的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及新型2-脫氧青蟹肌糖還原酶和編碼該酶的基因。另外，本發明涉及 (-)-vibo-櫟醇的制造方法，該方法中利用了能夠將2-脫氧青蟹肌糖直接轉換為(-)-vibo-櫟醇的酶。
【背景技術】
[0002] (-)-vibo-櫟醇（（1R，2R，4S，5R)_環己烷-1，2,3,4,5-五醇)是從蘿蘑科植物中發 現的具有下述化學結構的化合物。
[0003] 【化1】
[0004]
[0005] 到目前為止，（-)-vibo-櫟醇顯示出具有強力的血糖效果作用。另外，可通過(-)_ vibo-櫟醇的氨基化得到的脫氧肌醇胺(歹'才奪シYyf'ミレ)和脫氧肌醇脒(テ'才奪シ彳7 ^^^乂)還是可作為各種醫藥農藥合成用中間體的化合物(專利文獻1和2)。
[0006] 進而，近年來還明確了（-)-vibo-櫟醇的工業有用性。例如，在專利文獻3中記載了 (-)-vibo-櫟醇作為用于防止燃料電池冷卻液凍結的添加劑是有用的。在用于該目的的情 況下，（-)-vibo-櫟醇在長期使用后也不會被氧化，認為其可維持適宜的特性。
[0007] 另外，在專利文獻4中著眼于(-)-vibo-櫟醇在溶解和凝固的過程中可進行大量潛 熱的吸熱和放熱這一點，公開了該化合物在用于有效地利用太陽熱的蓄熱或低廉的夜間電 力的蓄熱材料中的應用。
[0008] 因此，通過簡單的工序有效地生產（-)-vibo-櫟醇明顯存在必要性。在將（-)_ vibo-櫟醇作為藥物的有效成分使用的情況下，該化合物的原料要盡可能純粹，而不應當含 有未經鑒定的雜質，因而其制造工序還應該盡可能地簡化、應該能夠容易地追溯其制造履 歷。另外，在上述那樣的工業目的中使用(-)-vibo-櫟醇的情況下，其生產成本能夠左右該 技術的實現性。
[0009] (-)-vibo-櫟醇在傳統上是從蘿蘑科植物中提取的。但是，近年來，作為更為有效 的方法，有人提出了下述的方法:將肌肉肌醇用作底物，進行土壤桿菌屬或沙門氏菌屬微生 物的培養，在其培養液中生產出（ + )-proto_櫟醇和( + )-epi-櫟醇以及(-)-vibo-櫟醇，由該 培養液分離出（-)-vibo-櫟醇。或者還提出了下述方法:使該土壤桿菌屬或沙門氏菌屬微生 物的菌體與肌肉肌醇接觸，仍然在其反應液中生產出（ + )-pr〇t〇-櫟醇和( + )-epi-櫟醇以及 (-)-vibo-櫟醇，由該反應液中分離出(_)-vibo-櫟醇(專利文獻1和2)。
[0010] 但是，在該方法中，并未分離出將肌肉肌醇轉換為(-)-vibo-櫟醇的任何酶，甚至 也未明確該反應是由1種酶所致的、還是有2種以上的酶參與其中。因此，在該方法中，由于 必須將肌肉肌醇作為底物進行微生物培養、或者至少要利用由該微生物的培養物得到的菌 體，因而其工序依然很繁雜，伴有被未知雜質污染的危險性。另外，該方法顯然效率低。
[0011] 在專利文獻5中還提出了下述的方法:在底物中使用肌肉肌醇對作為腸桿菌屬微 生物的腸桿菌sp.AB10114(FERM P-19319)進行培養，在其培養液中生產(-)-vibo-櫟醇，由 該培養液分離出（-)-vibo-櫟醇。在該方法中，由肌肉肌醇以約25%左右的收率得到了（-)-vibo-櫟醇(參照實施例1)。但是，該方法中也仍然未分離出將肌肉肌醇轉換為(-)_vib〇-櫟 醇的任何酶。因而，在該方法中也必須將肌肉肌醇作為底物進行微生物培養，從而其工序依 然很繁雜，伴有被未知雜質污染的危險性。另外，在該方法中，在得到目的（-)-vibo-櫟醇 時，甚至無法避免要求勞力和時間的微生物發酵工序。
[0012] 另外，在專利文獻6中，公開了通過與上述專利文獻5的方法中使用的腸桿菌 sp.AB10114(FERM P-19319)接觸而將(-)-vibo-櫟醇轉換為2-脫氧青蟹肌糖的方法。即，腸 桿菌sp.AB10114(FERM P-19319)以大致80%的收率將(-)-vibo-櫟醇轉換為2-脫氧青蟹肌 糖(參照實施例1)。由于在專利文獻6中也未分離出任何酶，因而其詳細情況尚不明確，但即 使假使該反應通過1種酶進行催化，那么至少該酶活性針對由（-)-vibo-櫟醇轉換為2-脫氧 青蟹肌糖的方向是占優勢的，認為實質上的逆反應難以進行應該是合理的。
[0013] 然而，本發明人截至目前尚未獲知報告了可按照下述反應路線圖所示將2-脫氧青 蟹肌糖直接轉換為(-)-vibo-櫟醇的酶的事實。
[0014] 【化2】
[0015]
2-脫氧青蟹肌糖=>(-)-vib〇-櫟醇
[0016] 現有技術文獻 [0017]專利文獻
[0018] 專利文獻1:日本特開平11-12210號公報
[0019] 專利文獻2:日本特開2000-4890號公報
[0020] 專利文獻3:國際公開第W02005/091413號小冊子
[0021] 專利文獻4:日本特開2010-215876號公報
[0022] 專利文獻5:日本特開2005-70號公報
[0023] 專利文獻6:日本特開2005-72號公報
【發明內容】
[0024]發明所要解決的課題
[0025]因此，本發明的目的在于通過簡單的工序有效地生產(-)-vibo-櫟醇。通過簡單的 工序進行的生產可將雜質混入的風險最小化。另外可推測出，通過有效的生產，還能夠在 (-)-V ibo-櫟醇的工業領域中加以利用。
[0026]特別謀求能夠將2-脫氧青蟹肌糖直接轉換為(-)-vibo-櫟醇的酶的應用。即，已知 2_脫氧青蟹肌糖（以下有時簡稱為"D0I"）可由葡萄糖通過僅僅兩個階段的酶反應容易地發 酵生產(W02010/109916號小冊子、W010/053052號小冊子和W006/109479號小冊子等），可期 待能夠成為非常低成本的原料。
[0027]解決課題的手段
[0028]本發明人篩選了具有(-)-vibo-櫟醇生產能力的微生物，發現了能夠將2-脫氧青 蟹肌糖轉換為(-)-vibo-櫟醇的微生物。本發明人進一步成功地由該微生物分離出了具有 將2-脫氧青蟹肌糖直接轉換為(-)-vibo-櫟醇的催化活性的酶。而且，本發明人解明了該酶 的氨基酸序列和編碼其的堿基序列。因此，本發明的第1方面包括下述方案。
[0029] (1) 一種2-脫氧青蟹肌糖還原酶，其來源于具有同化(-)-vibo-櫟醇的能力的微生 物，其中，該2-脫氧青蟹肌糖還原酶具有下述(a)~(c)的特性，
[0030] (a)具有將2-脫氧青蟹肌糖轉換為(-)-vibo-櫟醇的催化活性；
[0031] (b)在ρΗ7·0~9.0顯示出最大活性;和
[0032] (c)利用SDS-聚丙烯酰胺電泳測定出的該酶的多肽部分的分子質量為36kDa。
[0033] (2)如上述（1)的2-脫氧青蟹肌糖還原酶，其中，上述微生物是屬于假單胞菌 (Pseudomonas)屬或伯克氏菌（Burkholderia)屬的微生物。
[0034] (3)-種蛋白質，其為下述(a)~(e)中的任意一種蛋白質：
[0035] (a)由序列編號2所表示的氨基酸序列構成的蛋白質；
[0036] (b)由與序列編號2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性（同一性）的氨基 酸序列構成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質；
[0037] (c)由與序列編號4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質；
[0038] (d)由與序列編號6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質;或
[0039] (e)由與序列編號8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質。
[0040] (4)如上述(3)的蛋白質，其中，上述蛋白質為(b)~（e)中的任意一種，但不包括由 序列編號2、4、6和8所表示的氨基酸序列構成的蛋白質。
[0041] (5) -種基因，其編碼上述(3)或(4)所述的蛋白質。
[0042] (6) -種基因，其由下述(a)或(b)的核苷酸序列構成，
[0043] (a)序列編號1所表示的核苷酸序列;或
[0044] (b)與由下述互補序列構成的DNA在嚴謹條件下雜交、且編碼具有2-脫氧青蟹肌糖 還原酶活性的蛋白質的核苷酸序列，所述互補序列與由序列編號1所表示的核苷酸序列中 的至少連續18個堿基構成的核苷酸序列互補。
[0045] (7)如上述(6)的基因，其中，上述(b)中的由至少連續18個堿基構成核苷酸序列是 選自由序列編號9、序列編號11、序列編號13、序列編號15、序列編號17、序列編號19、序列編 號21和序列編號23組成的組中的序列的全部或一部分。
[0046] 另外，根據本發明，還提供了具有將2-脫氧青蟹肌糖直接轉換為(-)-vibo-櫟醇的 催化活性的酶的生產方法。因此，本發明的第2方面謀求下述方案。
[0047] (8)-種(-)-vibo-櫟醇轉換用重組載體，其包含上述(5)~(7)中的任一種基因。
[0048] (9)-種(-)-vibo-櫟醇轉換用轉化體，其導入有上述(5)~(7)中的任一種基因或 上述(8)的重組載體。
[0049] (10)-種2-脫氧青蟹肌糖還原酶的生產方法，其特征在于，將上述(9)的轉化體在 適于具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質的生產的條件和時間下進行培養，由培養物 中提純該蛋白質并進行回收。
[0050] 另外，本發明提供了使用上述酶的（-)-vibo-櫟醇的生產方法。關于該生產方法， 本發明人針對本發明人首次發現的本發明的2-脫氧青蟹肌糖還原酶進行了氨基酸序列同 源性檢索，其結果發現，目前為止據推測具有肌醇2-脫氫酶活性的幾種蛋白質與本發明的 新型2-脫氧青蟹肌糖還原酶顯示出很高的氨基酸同源性，并且具有將2-脫氧青蟹肌糖直接 轉換為(-)-vibo-櫟醇的催化活性。在本發明人的所知范圍內，并無報告指出這些蛋白質具 有將2-脫氧青蟹肌糖直接轉換為(-)-vibo-櫟醇的催化活性。
[0051] 因此，本發明的第3方面如下所述。
[0052] (11)-種(-)-vibo-櫟醇的制造方法，其特征在于，使上述(1)或(2)的2-脫氧青蟹 肌糖還原酶與2-脫氧青蟹肌糖接觸，在pH5.0~10.0的條件下發生反應，將所生成的（-)_ vibo-櫟醇由反應液中回收。
[0053] (12)-種(-)-vibo-櫟醇的制造方法，其特征在于，使下述(a)~(e)中的任意一種 蛋白質與2-脫氧青蟹肌糖接觸，在pH5.0~10.0的條件下發生反應，將所生成的(-)-vibo-櫟醇由反應液中回收，
[0054] (a)由序列編號2所表示的氨基酸序列構成的蛋白質；
[0055] (b)由與序列編號2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質；
[0056] (c)由與序列編號4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質；
[0057] (d)由與序列編號6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質;或
[0058] (e)由與序列編號8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質。
[0059]進而，根據本發明，提供了使用上述酶將2-脫氧青蟹肌糖轉換為(-)-vibo-櫟醇的 方法。因此，本發明的第4方面如下所述。
[0060] (13)-種將2-脫氧青蟹肌糖轉換為（-)-vibo-櫟醇的方法，其特征在于，使上述 (1)或(2)所述的2-脫氧青蟹肌糖還原酶與2-脫氧青蟹肌糖接觸，在PH5.0~10.0的條件下 發生反應。
[0061] (14)-種將2-脫氧青蟹肌糖轉換為(-)-vibo-櫟醇的方法，其特征在于，使下述 (a)~(e)中的任意一種的蛋白質與2-脫氧青蟹肌糖接觸，在pH5.0~10.0的條件發生反應，
[0062] (a)由序列編號2所表示的氨基酸序列構成的蛋白質；
[0063] (b)由與序列編號2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質；
[0064] (c)由與序列編號4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質；
[0065] (d)由與序列編號6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質;或
[0066] (e)由與序列編號8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列構 成、且具有2-脫氧青蟹肌糖還原酶活性的蛋白質。
[0067]發明的效果
[0068]根據本發明，可提供一種催化新型反應的酶。通過使用本發明的酶，能夠簡單且有 效地生產(-)-vibo-櫟醇。
【附圖說明】
[0069] 圖1示出了經確認具有將2-脫氧青蟹肌糖轉換為(-)-vibo-櫟醇的能力的微生物 的16SrRNA基因序列。
[0070] 圖2是示出了對于本發明的2-脫氧青蟹肌糖還原酶（以下有時簡稱為"D0I還原酶" 或"D0IR"）的來自各提純階段的試樣進行SDS-PAGE的結果的