一株少動鞘氨醇單胞菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體是涉及一株少動鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas paucimobilis)及其在發酵生產威蘭膠中的應用。
【背景技術】
[0002] 威蘭膠(welan gum編號S-130)是由某些產堿桿菌Alcaligenes sp.或鞘氨醇單胞 菌Sphingomonas sp.合成的微生物雜多糖，是美國斯比凱可公司（CP Kelco)20世紀80年代 繼黃原膠、結冷膠之后開發的第3代微生物胞外多糖之一，其分子量高達數百萬。它的結構 骨架由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重復單元構成，側鏈由單一的L-甘露糖 或L-鼠李糖構成，結構如圖1所示;威蘭膠水溶液具有假塑性流體特征，其低濃度水溶液具 有很高的粘度，并具有良好的穩定性，溫度升高至150°C時，其黏度基本不變，其耐溫極限值 比黃原膠高20~30°C。威蘭膠水溶液對酸、堿穩定，其黏度在pH2~13范圍內基本不受影響； 威蘭膠溶液具有獨特的剪切稀釋性能，這一點在石油鉆井中發揮突出的作用。威蘭膠溶液 的獨特性質超越許多其它多糖，可作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑、潤滑劑、成膜劑和 粘合劑應用于石油、混凝土、食品、油墨等工業。
[0003] 目前僅美國Kelco公司商業化生產威蘭膠，國內尚無商業化生產的報道，國內研究 尚處于實驗室研究的起步階段。
【發明內容】
[0004] 為克服上述現有技術中存在的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一株少動 鞘氨醇單胞菌。
[0005] 本發明的另一目的在于提供上述少動鞘氨醇單胞菌的應用。上述的少動鞘氨醇單 胞菌應用于發酵生產威蘭膠，并提供發酵生產威蘭膠的方法。
[0006] 本發明的目的通過下述技術方案實現:一株少動鞘氨醇單胞菌，所述的少動鞘氨 醇單胞菌命名為少動鞘氨醇單胞菌Y5(Sphingomonas paucimobilis Y5)，保藏于中國典型 培養物保藏中心;保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏號為:CCTCC Ν0:Μ 2015523;保藏起 始日期為2015年9月11日。
[0007] 所述的少動鞘氨醇單胞菌Y5是本申請發明人從酒精廢水處理廠活性污泥分離并 篩選得到。
[0008] 所述的少動鞘氨醇單胞菌Y5,在營養瓊脂(NA)平板上菌落形態見圖2,為圓形，黃 色，濕潤，凸起生長，菌落直徑為1~5mm;顯微鏡檢為革蘭氏陰性細菌，氧化酶試驗為陽性， 接觸酶試驗為陰性。
[0009] 所述的少動鞘氨醇單胞菌Y5,對少動鞘氨醇單胞菌Y5的16s rDNA進行測序與分子 比對，其與鞘氨醇單胞菌（sphingomonas sp.)16s rDNA核苷酸序列同源性為98%。其中少 動鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis)Y5的 16s rDNA序列如SEQ ID NO: 1 所不。
[0010] 所述的少動鞘氨醇單胞菌Y5,經梅里埃API 20NE鑒定條鑒定為少動鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas paucimobilis)〇
[0011 ] 本發明所述的少動鞘氨醇單胞菌Y5(Sphingomonas paucimobilis Y5)可用于發 酵生產威蘭膠。
[0012] 當小量搖床發酵培養時，所述發酵生產威蘭膠的具體方法為:從活化的少動鞘氨 醇單胞菌Y5菌種斜面挑取1~2環菌種接種到種子培養基，28~32°C，180~200r/min搖床培 養16~18h得到種子液，然后按5%~10% (v/v)接種量接種到發酵培養基，搖床培養條件為 28~32°C，200~250r/min發酵65~72h;發酵液經回收過程獲得威蘭膠。
[0013] 當大量發酵罐培養時，所述發酵生產威蘭膠的具體方法為:從活化的少動鞘氨醇 單胞菌Y5菌種斜面挑取1~2環菌種接種到種子培養基，28~32°C，180~200r/min搖床培養 16~18h得到種子液，然后按5%~10% (v/v)接種量接種到發酵培養基，發酵罐培養條件為 溫度28~32°C，攪拌速度400~800r/min發酵65~72h，通氣量1.0vvm，pH 6.0~7.0,罐壓 0.01~0.03Mpa;發酵液經回收過程獲得威蘭膠。
[0014]所述的種子培養基的成份及含量為：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， K2HPO4 · 7H20 2g/L，MgS〇4 · 7H20 0.1g/L，溶劑為水。
[0015] 所述的發酵培養基包括碳源、氮源、無機鹽;發酵培養基初始pH 6.0~8.0;所述的 碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉類水解液中的一種或幾種，用量為40~60g/L;所述的氮源為牛肉 膏、蛋白胨、酵母膏、NaN〇3中的一種或幾種，用量為3~5g/L;所述的無機鹽為K2HPO4 · 7H2〇 和MgS〇4 · 7H2O,用量分別為2~4g/L和0.1~0.3g/L。
[0016] 作為優選的實施方式，所述的發酵培養基還包括表面活性劑，所述的表面活性劑 為吐溫80，司盤，脂肪酸甘油酯的一種或幾種，用量為0.5~lg/L。
[0017] 在威蘭膠的生產方法中，所述的產品回收過程包括預處理、提取、干燥、粉碎和過 篩過程，具體步驟如下：
[0018] 1)預處理:發酵液經80°C滅活20min，蛋白酶處理結合離心、過濾除去菌體和不溶 性雜質；
[0019] 2)提取:加入1 · 5~2倍體積有機溶劑提取；
[0020] 3)干燥:有機溶劑分離得到的沉淀60°C干燥；
[0021 ] 4)粉碎:所得干燥的威蘭膠用粉碎機粉碎；
[0022] 5)過篩:粉碎后的威蘭膠過60~120目篩，即得不同規格的威蘭膠產品。
[0023] 步驟2)中所述的有機溶劑為乙醇、甲醇或異丙醇中的一種或幾種。
[0024] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
[0025] 1)本發明分離篩選得到一株少動鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis) Y5,可利用碳源，氮源，無機鹽和水，在合適的條件下發酵生產威蘭膠，所需營養成分簡單， 操作方便。
[0026] 2)該菌株發酵生產的威蘭膠品質好，1 %水溶液粘度達到3500mPa · S，耐酸堿(ρΗ2 ~13范圍類性質穩定），耐高溫(溫度升高至150°C時粘度基本不變）。
[0027] 3)該菌株發酵時糖轉化率較高，達到55%~60%，產量較高，達到了25~32g/L(干 重)。
【附圖說明】
[0028]圖1為威蘭膠的分子結構骨架示意圖；
[0029]圖2為少動鞘氨醇單胞菌Y5在營養瓊脂上的菌落形態圖。
【具體實施方式】
[0030]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0031 ] 實施例1少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)Y5的分離篩選 [0032]分離:取酒精廢水廠的活性污泥樣品，用無菌水作10倍梯度稀釋，然后涂布于LB瓊 脂平板，30°C培養。
[0033]初篩:挑取個頭大，有粘性，表面光滑，濕潤的單菌落用于復篩。
[0034]復篩:初篩挑取的單菌落分別接種于液體培養基(葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，酵母 粉lg/L，K2HP〇4 · 7H20 2g/L，MgS〇4 · 7H20 0.2g/L)，30°C，200r/min搖床培養，最終篩選出發 酵液粘度和粗糖產量高的菌株少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobi 1 is)Y5。
[0035] 實施例2少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobi 1 is)Υ5的鑒定
[0036] 1)菌落形態與鏡檢，結果如圖2所示：
[0037]在營養瓊脂(NA)平板上菌落形態為圓形，黃色，濕潤，凸起生長，菌落直徑為1~ 5mm;顯微鏡檢為革蘭氏陰性細菌。
[0038] 2)氧化酶與接觸酶檢驗：
[0039]氧化酶試驗為陽性，接觸酶試驗為陰性。
[0040] 3)16s rDNA鑒定：
[0041 ] 用接種環挑取2~5個菌落轉移至TE中，37°C溫育1.5h，加入NaCl和CTAB溶液混勻， 65°C溫育10min，加入酚-氯仿-異戊醇溶液抽提，離心10min，吸取上清轉移至新的EP管內， 再用氯仿-異戊醇提取2次，轉移至新的EP管中，再加入異丙醇沉淀DNA，4°C靜置20min，離心 棄上清，加入70 %乙醇洗滌沉淀，加入TE，溶解沉淀。-20°C保存。將上述提取的總DNA稀釋10 倍作為模板，以 F2 7 (CCGGATCCAGAGTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT )和R1492 (CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC)作為引物擴增待測細菌的 16s rDNA。擴增物由 上海英駿生物技術有限公司進行測序，測序結果提交到GENBANK(http : // www · ncbi · nlm. nih · gov/blast)進行比對，結果表明與Sphingomonas sp · ZJ01 同源性達到 98%，歸屬于鞘氨醇單胞菌屬。其中：擴增待測細菌的16s rDNA的測序序列結果如下：
[0042]
[0044] 4)API 鑒定：
[0045] 用滅菌的棉拭子挑取新鮮的菌落，接種至API 20NE接種液中，制成濁度為2個麥氏 單位的菌懸液。將菌懸液接種至API 20NE鑒定條，30°C培養48h觀察生化反應，并用API鑒定 系統軟件分析，得到鑒定結果為:試驗條API 20NE V7.0，生化譜0463340，有意義的分類單 位為Sphingomonas paucimobilis，鑒定％為99·8，T值（T指數）0·93〇
[0046] 實施例3少動鞘氨醇單胞菌Υ5發酵生產的微生物多糖檢測分析。
[0047] 菌株發酵生產的多糖聚合物溶于水，不溶于醇、酮等有機溶劑。
[0048] 通過苯酚-硫酸法和硫酸-咔唑法測得多糖樣品中葡萄糖醛酸含量為12% ;通過