鞘氨醇單胞菌T-3及其共發酵生產生物多糖和聚β羥基丁酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術和生物材料領域，具體涉及利用微生物發酵的方法同時合成 生物多糖和聚0羥基丁酸的方法。
【背景技術】
[0002] 鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp)是根據16s rRNA序列，呼吸醌種類和細胞極 性脂模式等特征提出的一個新屬。區別于其它革蘭氏陰性菌的重要特征是其細胞膜中含有 鞘糖脂，而無脂多糖。鞘氨醇單胞菌屬廣泛分布于水體，土壤和空氣中。目前，對于鞘氨醇 單胞菌屬的研究主要集中在該菌屬具有降解難降解有機污染物的能力，比如二苯呋喃可被 Sphingomonas sp.RWl作為唯一的碳源物質利用；具有合成0胡蘿卜素的能力；具有合成 一類酸性的莢膜多糖的能力，這些莢膜多糖的結構相似但不盡相同，其統稱為鞘氨醇膠。
[0003] 目前，已經大量生產并廣泛應用的鞘氨醇膠主要包括：Sphingomonas elodea ATCC3161 合成的結冷膠，Sphingomonas sp. ATCC31555 合成的韋蘭膠，Sphingomonas sp.ATCC53159合成的迪特膠，Sphingomonas sp.ATCC31961合成的鼠李膠等。此類鞘氨醇 膠具有相對保守的主鏈結構，而側鏈基團的種類、位置則具有極大的多樣性，這使鞘氨醇的 結構和功能更加豐富，從而賦予了每一種鞘氨醇膠獨特的物理性質。比如沒有糖基側鏈的 結冷膠能形成凝膠，從而在食品、日化和醫學上得到了廣泛的應用；具有鼠李糖或甘露糖側 鏈的韋蘭膠，能形成耐酸、耐堿、耐高溫的高粘度的溶液，具有一個或兩個鼠李糖側鏈的迪 特膠在低濃度條件下即可形成高粘度的溶液，在建筑、鉆井、采油等高技術領域應用廣泛； 隨著生物技術的發展，越來越多的可產鞘氨醇膠的菌株被鑒定，而這些新發現的天然聚合 物資源在未來的生物膠應用中必將發揮更加重要的作用。
[0004] 聚0羥基丁酸是微生物在營養不均衡條件下（如碳源過剩、而其它的氮、磷、硫源 限制）積累在體內作為其營養和能量儲存物質參與細胞代謝的天然產物。而聚0羥基丁 酸的生產主要靠優化純菌株生產條件，重組大腸桿菌過量表達以及活性污泥中微生物菌群 合成來得到，目前，可用于生產聚0羥基丁酸的菌屬主要有產堿桿菌屬，芽孢桿菌屬等。聚 3羥基丁酸具有良好的生物降解性，其分解產物可全部為生物利用，對環境無污染，是一種 可完全分解的熱塑性塑料。同時，作為一種生物合成材料，還具有生物相容性、壓電性、抗凝 血性、密度大、光學活性好和透氧性低等優點，可望在電子、光學、生物醫學等高技術領域獲 得應用。
[0005] 目前，還沒有關于共同生產生物多糖和聚3羥基丁酸的報道。盡管在 Sphingomonas elodea ATCC3161 發酵結冷膠和 Sphingomonas sp.ATCC53159 發酵迪特膠 的過程中，有少量的聚0羥基丁酸在菌體內產生，但是在生產中，人們卻利用化學突變的 方法篩選到了不產聚 0 羥基丁酸的 Sphingomonas elodea ATCC3161 和 Sphingomonas SP.ATCC53159的突變菌株，使其更高效的專一的生產結冷膠和迪特膠。主要原因是因為： 首先這兩株菌中聚3羥基丁酸的產量較低；其次，結冷膠和迪特膠與聚3羥基丁酸的分離 需要經過稀釋，膜分離的過程，分離后稀釋發酵液中結冷膠和迪特膠的提取需要多倍稀釋 發酵液體積的乙醇提取，成本很高；同時，少量聚0羥基丁酸的存在影響了結冷膠和迪特 膠的特性，限制了結冷膠和迪特膠的應用。
[0006] 在工業生產中如果有一株能同時大量生產生物多糖和聚0羥基丁酸的菌株，且 兩種產物能簡單有效的分離，同時具有低成本的提取方法，那么這兩種產物的共同發酵則 會極大地降低生產成本，減少生物多糖和聚3羥基丁酸單獨發酵造成的資源浪費，促進兩 種產物的工業化生產應用。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的之一是提供一株可同時大量生產生物多糖和聚P羥基丁酸的鞘氨 醇單胞菌 Sphingomonas sp. T-3。
[0008] 本發明的第二個目的是提供利用鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. T-3發酵同時大 量生產生物多糖和聚3羥基丁酸的方法。兩種產物分離方法簡單，提取成本低，減少了生 物多糖和聚3羥基丁酸單獨發酵造成的資源浪費，促進兩種產物的工業化生產應用。
[0009] 本發明所提供的菌株Sphingomonas sp. T-3分離自土壤，在固體平板上表現為菌 落成圓形凸起，邊緣整齊濕潤、粘稠、乳白色。革蘭氏呈陰性。利用超薄切片技術處理發酵初 期和發酵末期的菌株，在投射電鏡下可看到生物多糖廣泛分布于胞外，而胞內則充滿了白 色的聚0羥基丁酸顆粒（圖1)。根據16S rDNA序列（見序列表），將其命名為鞘氨醇單 胞菌Sphingomonas sp.T-3。該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），保藏編號為：CGMCC No. 10150,保藏日期為2014年12月10日。
[0010] 本發明所述共發酵生產生物多糖和聚0羥基丁酸的方法包括：
[0011] (1)將鞘氨醇單胞菌T-3單菌落接種至5ml的TPG液體培養基中，30°C振蕩培養 24小時；
[0012] (2)將步驟（1)制得的培養液以1 %的接種量接種至100或300ml的種子培養基 中，30°C振蕩培養24小時；
[0013] (3)以10%的接種量將步驟（2)制得的種子液接種至玻璃搖瓶或發酵罐中，30°C， 恒定pH 7. 2,培養72小時；
[0014] (4)將步驟（3)的發酵液用蒸餾水至少5倍體積稀釋，90~105°C加熱15分鐘，膜 分離發酵液和菌體沉淀；
[0015] (5)將步驟（4)中膜分離后的上清液用稀鹽酸調節pH至3.0得到果凍狀沉淀，沉 淀經NaOH調節至pH中性，將調節至pH中性的沉淀烘干得到生物多糖；
[0016] (6)將步驟（4)中的菌體沉淀經烘干后研磨成粉末，加氯仿抽提，低速離心5分鐘， 上清液經60°C烘干除去氯仿，得到聚0羥基丁酸；
[0017] 其中：
[0018] TPG液體培養基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，牛肉浸粉3g/L ;
[0019]種子培養基：蔗糖 l〇g/L，蛋白胨 2. 5g/L，酵母粉 1. 5g/L，K2HP042. 5g/L， MgS040. lg/L, pH 7. 0 ；
[0020] 發酵培養基：葡萄糖30~50g/L，豆餅粉0? 5~2g/L，K2HP04l~2g/L，MgS040. 1~ lg/L，NaN03l~2g/L，pH 7. 0。
[0021] 本發明方法生產的生物多糖具有明顯的增稠作用，良好的剪切稀釋性能和耐溫、 耐酸堿和抗鹽性能，生物乳化性能以及成凝膠特性，可應用于建筑，食品，醫療，鉆井和采油 等高技術領域。生產的聚3羥基丁酸作為一種生物可降解材料，可應用于電子、光學和生 物醫學等高技術領域。
[0022] 本發明的優點和積極效果：
[0023] 鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. T-3可同時高效發酵生產生物多糖和聚0羥基 丁酸。胞外產物生物多糖與胞內聚合物聚0羥基丁酸的積累均傾向于利用相同的高C/N 比的條件。兩者分離提取工藝簡單、成本較低。分離后的上清液可利用低成本的酸沉法提 取，沉淀則用來提取聚3羥基丁酸。因此，共同發酵生物多糖和聚3羥基丁酸可充分利用 資源、底物，具有很好的工業價值。
【附圖說明】
[0024] 圖1是鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas sp. T-3發酵初期和發酵末期的超薄切片分 析。胞內的白色顆粒為聚0羥基丁酸顆粒，而胞外的纖維狀聚合物即為生物多糖。其中A， 發酵2h時菌株的透射電鏡圖；B，發酵72h時菌株的透射電鏡圖；
[0025] 圖2是Sphingomonas sp. T-3的進化樹；
[0026] 圖3是不同培養基配方的產量分析圖；
[0027] 圖4是鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas sp. T-3分批發酵的動力學曲線圖；
[0028] 圖5聚0羥基丁酸含量與峰面積的標準曲線
[0029] 圖6是生物多糖樣品的氣相色譜圖分析。其中，1指鼠李糖，2指甘露糖，3指葡萄 糖，4指內標肌醇六乙酸酯；
[0030] 圖7是1. 2%生物多糖凝膠的力-時間曲線圖；
[0031] 圖8是不同濃度生物多糖形成凝膠的TPA測試圖。具體為硬度、彈性、粘附性、內 聚性、膠粘性、咀嚼性及回復性隨生物多糖濃度的變化曲線圖；
[0032] 圖9是鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas sp. T-3產物聚0羥基丁酸的400M核磁共 振氫譜圖。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp. T-3的篩選及鑒定
[0034] 該菌株分離自石油污染的土壤中。
[0035] 具體實施步驟如下：取lg新鮮土樣與9ml滅菌的0. 9%的生理鹽水震蕩混勻，取 上清接種至已滅菌的l〇〇ml菌株篩選液體培養基中，30°C震蕩培養7天富集菌種。然后用 0.9%的生理鹽水稀釋涂布菌液，將1(T2, 1(T3兩個梯度分別吸取200 yL涂布至篩選培養基 的固體平板，30°C靜置培養3天后，觀察生長菌株的菌落形態。選取菌落大且厚，邊緣整齊， 似有胞外多糖產生的單菌，經革蘭氏染色、16S rDNA基因序列（見序列表）分析以及BI0L0G 微生物分類鑒定系統確定該菌株為鞘氨醇單胞菌，命名為Sphingomonas sp. T-3。其進化關 系如圖2所示。保藏編號為：CGMCC No. 10150。
[0036] 其中：
[0037] 篩選液體培養基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，NaCl 3g/L ;
[0038] 篩選固體培養基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，NaCl 3g/L，瓊脂粉 15g/L ;
[0039] 實施例2、在搖瓶中共同生產生物多糖和聚0羥基丁酸
[0040] (1)將鞘氨醇單胞菌T-3單菌落接種至5ml的TPG液體培養基中，30°C振蕩培養 24小時；
[0041] (2)將步驟（1)制得的培養液以1 %的接種量接種至100ml的種子培養基中，30°C 振蕩培養24小時；
[0042] (3)以10%的接種量將步驟（2)制得的種子液接種至含55ml發酵培養基的的玻 璃搖瓶中，30°C，恒定pH 7. 2,培養72小時；
[0043] (4)將步驟（3)的發酵液用蒸餾水至少5倍體積稀釋，90~105°C加熱15分鐘，膜 分離發酵液和菌體沉淀；
[0044] (5)將步驟（4)中膜分離后的上清液用稀鹽酸調節pH至3.0得到果凍狀沉淀，沉 淀經NaOH調節至pH中性，將調節至pH中性的沉淀烘干得到生物多糖；
[0045] (6)將步驟（4)中的菌體沉淀經烘干后研磨成粉末，加氯仿抽提，低速離心5分鐘， 上清液經60°C烘干除去氯仿，得到聚0羥基丁酸；
[0046] 其中：
[0047] TPG液體培養基：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，牛肉浸粉3g/L ;
[0048] 種子培養基：蔗糖 10g/L，蛋白胨 2. 5g/L，酵母粉 1. 5g/L，K2HP042. 5g/L， MgS040. lg/L, pH 7. 0 ；
[0049] 發酵培養基：以不同底物量發酵，配方分別為
[0050] 配方一：葡萄糖 30g/L，豆餅粉 0? 5g/L，K2HP04lg/L，MgS040. llg/L，NaN03lg/L，pH 7. 0。
[0051] 配方二：