檢測egfr基因l858r位點的特異性引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子檢測，具體地說，設及檢測EGFR基因 L858R突變位點的特異性引 物、探針及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 表皮生長因子受體巧pidermal Growth Factor Rec邱tor,EGFR)是上皮生長因子 化GF)細胞增殖和信號傳導的受體。EGFR屬于皿R或化bB受體家族的一員，該家族包括EGFR 化rbB-1)、肥R2/c-neu 巧rbB-2)、Her 3 化rbB-3)和Her 4 (化bB-4) dEGFR也常被稱作肥R1 或 ErbBl dEGFR及其家族成員能夠調控細胞分化、調亡、細胞運動、新血管生成、浸潤和轉移等 多項生理過程，同時在大部分的人類腫瘤中都有表達，因此EGFR已經被證明在眾多腫瘤的 發生、發展及預后過程中發揮了重要調控作用。
[0003] EGFR是典型的具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase，ΤΚ)活性的受體，TK在EGFR的活 性中發揮了關鍵作用。美國FDA批準對擬采用易瑞沙、特羅凱等EGFR-TKI治療的患者，進行 EGFR基因突變檢測。需要指出，檢測EGFR基因突變并不能作為患者是否患癌的依據。在我國 《NCCN:非小細胞肺癌臨床實踐指南（中國版)》中只是明確提出了臨床實踐中EGFR-TKI治療 前需要針對EGFR編碼區第18、19、20和21外顯子的突變位點開展檢測。
[0004] CN103740843A公開了 一種檢測人表皮生長因子受體基因 EGFR外顯子21上L858R點 突變的方法及試劑盒；W數字PCR為平臺，在反應體系中加入PCR引物和化qMan探針，利用兩 條標記不同類型巧光的化qMan探針對野生和突變DNA模板進行檢測；根據巧光類型判斷樣 品中DNA模板的類型及其數量及比例。但該技術方案的引物探針組合的突變檢出率僅能達 到2500分之一。
[0005] CN103333963A公開了一組用來檢巧化GFR基因 L858R點突變的引物組及用此引物組 來檢測EGFR基因 L858R點突變的方法。然而，其只有引物序列，檢測效率不如探針法，不能檢 出突變頻率。
[0006] CN102851375A公開了一種檢測EGFR基因突變的引物、探針及其試劑盒和使用方 法。其能夠檢出含0.1~1 %EGFR基因突變DNA的樣本，但血液循環游離核酸的突變有時低于 該頻率，因此該技術方案不適用于血液循環游離核酸的檢測。
【發明內容】
[0007] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種用于檢測血液循環游 離核酸中EGFR基因 L858R位點的特異性引物、探針及試劑盒。
[000引為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：
[0009] 第一方面，本發明提供一種用于檢巧化GFR基因 L858R位點的特異性引物，其核巧酸 序列為：
[0010] 前向引物:ACACCGCAGCATGTCAAGATC;
[0011 ]反向引物:CAGCCTGGTCCCTGGTGTCAG。
[0012] 第二方面，本發明提供與所述引物配合使用的探針，其核巧酸序列為：
[0013] VIC:5 '-VIC-GGCCAGCCCAAA-MGB-NFQ-3 '；
[0014] FAM：5'-FAM-GGCCCGCCCAAA-MGB-NFQ-3'〇
[0015] 第Ξ方面，本發明提供含有所述引物和所述探針的試劑。
[0016] 第四方面，本發明提供含有所述引物和所述探針的試劑盒。
[0017] 第五方面，本發明提供一種檢測血液循環游離核酸中EGFR基因 L858R位點的方法， W血液游離核酸為模板，利用所述引物和所述探針進行數字PC閲金證，數字PCR依據檢測巧 光信號給出拷貝數判定結果。
[001引數字PCR檢測方法具體為：
[0019] 標準PCR反應體系經過微滴發生后，分配到約20000個微滴中，每個微滴包含或不 包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板），實現"單分子模板PCR擴增"，擴增結束后，含有 核酸分子模板的微滴會給出巧光信號，沒有模板的微滴就沒有巧光信號產生。最終根據泊 松分布原理W及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢祀分子的濃度或拷貝數。數字 PCR可W直接計算目標序列的拷貝數，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可W進行精 確的絕對定量檢測;此外，由于數字PCR在進行結果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態，因此 也不需要檢測巧光信號與設定闊值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數字PCR的反 應受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高;數字PCR實驗中標 準反應體系分配的過程可W極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度。計 算給出待檢祀分子的濃度或拷貝數。
[0020] 數字P邸驗證實驗流程為：
[0021] 配制PCR反應液，配置后室溫靜置3分鐘。將靜置后的PCR反應液轉移到DG8微滴發 生卡中的樣品槽，再加入微滴發生專用油。放入QXSOODroplet Generator中進行微滴發生 反應。轉移生成好的微滴到96孔板。覆上PCR粘性封錐片使用熱封儀進行封片。隨后轉移至 PCRW進行擴增反應，反應條件為95°C10分鐘；94°C30秒，60°C1分鐘，40個循環；98°C10分 鐘;4°C持續。反應完成后放入QXSOODroplet Reader進行信號讀取;對數據進行分析。
[0022] 本發明還提供了適用于微滴式數字PCR系統的該突變位點的檢測體系。具體包括： 2 X dd PCR預混液lOul，lOuM前向引物lul，lOuM反向引物lul，2uM的野生型探針2ul，2uM的 突變型探針化1，水3ul，模板lul，共20ul。
[0023] 本發明的有益效果在于：
[0024] 本發明提供了用于檢測血液循環游離核酸中EGFR基因 L858R位點的方法和檢測試 劑盒，適用于對非小細胞肺癌病人祀向用藥厄洛替尼片，吉非替尼等的評估。本發明提供的 用于檢測EGFR基因 L858R的方法為MGB-化qman探針方法，不僅適用于對腫瘤組織，石蠟包埋 組織來源的核酸進行檢測，更加適用于對血液循環游離核酸中EGFR基因 L858R突變的位點 的檢測;且結合該檢測體系和微滴式數字PCR系統可對核酸樣本的突變頻率進行準確檢出。 檢測該突變位點的引物和探針序列如下文所示，本發明還提供了對EGFR基因 L858R突變位 點進行拷貝數檢測的試劑盒。本發明提供的EGFR基因 L858R突變位點檢測方法肺癌祀向用 藥，病情監測和預后評估方面，為臨床提供了有效的指導。
[0025] 本發明提供的特異性引物和探針，能夠對血液游離核酸進行準確檢測，在檢測突 變同時可W直接給出基因位點的突變頻率，且結合數字PCR系統對突變的檢出可達5000分 之一，靈破度局。
【附圖說明】
[0026] 圖訪本發明實施例3中W包含EGFR基因 L858R突變位點的突變質粒(mu化nt)和包 含該位點野生型的質粒(WT)為模板，用微滴式數字PCR系統對探針的特異性和靈敏度進行 測試。
[0027] 圖2為本發明實施例3中野生型質粒(WT)終濃度從0.01到O.OOOlng時，WT探針檢測 從11000至Ij453個拷貝不等，mu化nt探針無檢出
[002引圖3為本發明實施例3中突變型質粒(mutant)終濃度從0.01到O.OOOOlng時，WT探 針無檢出，mu化nt探針檢出從1000000到40個拷貝不等。
[0029] 圖4為本發明實施例3中11個樣本分別進行檢測的結果對比。
[0030] 圖5為本發明實施例3中11個樣本的EGFR基因的L8 5 8 R位點的野生型拷貝進行檢 巧。，結果是11個樣本均有野生型拷貝檢出。
[0031 ]圖6為本發明實施例3中11個樣本的EGFR基因的L858R位點的突變型拷貝進行檢 巧。，結果是只有第Ξ個樣本有突變型拷貝檢出。
[0032]圖7為本發明實施例3中引物和探針對7個腫瘤患者血液游離核酸進行檢測的統計 結果。
[00削圖8為本發明實施例帥7個循環游離DNA樣本的EGFR基因的L858R位點的野生型拷 貝進行檢測，結果是7個樣本均有野生型拷貝檢出。
[0034] 圖9為本發明實施例帥7個循環游離DNA樣本的EGFR基因的L858R位點的突變型拷 貝進行檢測，結果只有第7個樣本有突變拷貝檢出。
【具體實施方式】
[0035] 下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是W下實 施例的給出僅是為了起到說明的