一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因編輯技術領域，尤其涉及一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法。
【背景技術】
[0002]轉錄激活樣效應因子核酸酶(transcript1nactivator-1 ike effectornuclease,TALEN)技術、鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)和成簇規律間隔短回文重復(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat ,CRISPR)技術是目前基因組編輯領域的三大技術。目前，TALEN和ZFN是發展比較成熟的兩種定點突變技術，但是，這兩種技術在構建載體過程可識別特異位點的核酸酶較為繁瑣，每一個位點需要構建兩個相應的核酸酶。
【發明內容】
[0003]基于【背景技術】存在的技術問題，本發明提出了一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法。
[0004]本發明提出了一種以CRI SPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，包括以下步驟:
[0005]SI，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術分別將香味基因各個外顯子及內含子處能被Cas9識別的序列打靶，然后對基因組DNA序列切割后引發DNA修復，從而產生缺失突變，獲得功能缺失的Badh2基因；
[0006]S2，將粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉化的受體材料，用成熟胚、幼穗和子房等為外植體誘導獲得二倍體愈傷組織，用花藥、花粉和未受精子房等為外植體誘導獲得單倍體愈傷組織，用農桿菌介導法將打靶載體導入愈傷組織細胞；
[0007]S3，將打靶載體導入到二倍體愈傷組織的細胞中，篩選陽性愈傷，分化成苗，鑒定遺傳轉化陽性植株，從Tl群體分離得到香稻品系;將打靶載體導入到單倍體愈傷組織的細胞中，篩選陽性愈傷，用秋水仙素加倍，分化成苗，鑒定遺傳轉化陽性植株，最終得到香稻品系O
[0008]優選的，所述基因敲除靶點應設在起始密碼子附近或其下游的外顯子區域，靶序列一般由19個堿基構成，靶序列前面必須是堿基G作為轉錄的起始信號，而靶序列末端的PAM序列必須是NGG，且靶序列必須具有唯一性。
[0009]優選的，將所述構建好的載體質粒DNA利用農桿菌感受態EHA105轉化到農桿菌，并抽質粒驗證表達載體的目的片段。
[0010]優選的，所述粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉化的受體材料，用農桿菌介導法實現遺傳轉化，獲得香味水稻植株，以下以鄂早17為例:
[0011](I)以鄂早17成熟胚，幼穗和子房等外植體的愈傷組織(二倍體)為受體，將打靶載體利用農桿菌介導法轉入到二倍體受體細胞中，經過篩選后再分化成苗，從Tl群體中篩選出純合的帶香味的植株。
[0012](2)以鄂早17為材料進行花藥，花粉和未受精子房等外植體愈傷組織(單倍體)為受體材料，利用農桿菌介導法將香味基因Badh2的打靶載體導入到單倍體愈傷組織中，用潮霉素篩選后，利用秋水仙素加倍處理，再分化成植株，這樣得到帶有香味基因的純合二倍體植株。
[0013]本發明中提到的CRISPR/Cas9是第三代基因編輯技術，其工作原理是細菌抵御降解入侵的噬菌體等外源DNA時，在前導區的調控下，CRISPR被轉錄為長的RNA前體，然后加工成一系列短的含有保守重復序列和間隔區的成熟crRNA，最終識別并結合到與其互補的外源DNA序列上發揮剪切作用。CRISPR/Cas9系統每個針對特異位點的crRNA只有十幾個堿基，整個載體較小。而TALEN和ZFN技術操作比較繁瑣，成本昂貴，特別是TALEN技術在構建過程中需要大量的分子克隆和測序操作，一般實驗室都無法操作。而CRISPR/Cas9系統只需要設計打靶位點，設計兩條單核苷酸鏈，與需要打靶的目的片段進行替換，構建相應的載體即可。此技術不僅具有可拓展性，而且構建載體的過程只需要幾步就可以完成，操作簡單方便，一般實驗室都可操作，本發明不僅以傳統的外植體愈傷組織為受體材料，同時還以花藥，未受精子房等外植體的愈傷組織(單倍體)為受體材料，將外源基因轉化后加倍即可得到純合的陽性植株，與常規的雜交育種方法相比，該方法大大節省了人力物力以及時間成本。
【具體實施方式】
[0014]下面結合具體實施例對本發明作進一步解說。
[0015]本發明提出的一種以CRI SPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，包括以下步驟:
[0016]S1、利用CRISPR/Cas9基因編輯技術分別將香味基因各個外顯子及內含子處能被Cas9識別的序列打靶，然后對基因組DNA序列切割后引發DNA修復，從而產生缺失突變，獲得功能缺失的Badh2基因；
[0017]S2、將粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉化的受體材料，用成熟胚、幼穗和子房等為外植體誘導獲得二倍體愈傷組織，用花藥、花粉和未受精子房等為外植體誘導獲得單倍體愈傷組織，用農桿菌介導法將打靶載體導入愈傷組織細胞；
[0018]S3、將打靶載體導入二倍體愈傷組織細胞，篩選、鑒定陽性植株，從Tl群體分離得到香稻品系；將打靶載體導入到單倍體愈傷組織的細胞中，篩選陽性愈傷，用秋水仙素加倍，分化成苗，鑒定遺傳轉化陽性植株，最終得到香稻品系。
[0019]本發明中，所述基因編輯的靶序列應設在起始密碼子附近或其下游的外顯子中，靶序列一般由19個堿基構成，靶序列前面必須是堿基G作為識別起始信號，而靶序列后面的PAM序列必須是NGG，且靶點序列必須具有唯一性;將所述構建好的載體質粒DNA利用農桿菌感受態EHA105轉化到農桿菌，并抽質粒驗證表達載體的目的片段。
[0020]本發明中，所述粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉化的受體材料，用農桿菌介導法實現遺傳轉化，獲得香味水稻植株，以下以鄂早17為例:
[0021](I)以鄂早17成熟胚，幼穗和子房等外植體的愈傷組織(二倍體)為受體，將打靶載體利用農桿菌介導法轉入到二倍體受體細胞中，經過篩選后再分化成苗，從Tl群體中篩選出純合的帶香味的植株。
[0022](2)以鄂早17為材料進行花藥，花粉和未受精子房等外植體愈傷組織(單倍體)為受體材料，利用農桿菌介導法將香味基因Badh2打靶載體導入到單倍體愈傷組織中，用潮霉素篩選后，利用秋水仙素加倍處理，再分化成植株，這樣得到帶有香味的純合二倍體植株。
[0023]遺傳轉化技術又稱為轉基因技術，是20世紀70年代從分子遺傳學基礎上發展起來的一門新技術，它是應用DNA重組技術，綜合采用了物理，化學以及生物學技術有目的的將外源基因或DNA片段導入到受體植物的細胞中。目前，應用比較廣泛的主要有農桿菌介導法和基因槍法，農桿菌介導法在植物轉基因技術上有廣泛的應用，該方法在導入外源DNA片段時在結構上是完整的，轉化效率較高，技術操作相對簡單。而基因槍法轉化成本較高，如果外源片段DNA較大時則很難通過該方法轉移，所以農桿菌介導法是目前植物遺傳轉化的首選，作為水稻遺傳轉化的受體材料，傳統方法都是以成熟胚，子房和幼穗外植體的二倍體愈傷組織為受體材料，雖然轉化效率較高，但后代需要自交才能分離出陽性植株，時間成本尚O
[0024]本發明中利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得Badh2基因，與TALEN和ZFN技術相比，操作過程簡單方便，節約成本，一般實驗室都可操作，而且用農桿菌介導法將香味基因Badh2打靶載體分別導入到二倍體和單倍體細胞組織中，與常規的雜交育種相比，大大節約了時間成本，是一種新的獲得香稻品系的分子育種方法。
[0025]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，其特征在于，包括以下步驟: SI，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術分別將香味基因各個外顯子及內含子處能被Cas9識別的序列打靶，然后對基因組DNA序列切割后引發DNA修復，從而產生缺失突變，獲得功能缺失的Badh2基因； S2，將粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉化的受體材料:用成熟胚、幼穗和子房等為外植體誘導獲得二倍體愈傷組織，用花藥、花粉和未受精子房等為外植體誘導獲得單倍體愈傷組織，用農桿菌介導法將打靶載體導入愈傷組織細胞； S3，將打靶載體導入到二倍體愈傷組織的細胞中，篩選陽性愈傷，分化成苗，鑒定遺傳轉化陽性植株，從Tl群體分離得到香稻品系;將打靶載體導入到單倍體愈傷組織的細胞中，篩選陽性愈傷，用秋水仙素加倍，分化成苗，鑒定遺傳轉化陽性植株，最終得到香稻品系。2.根據權利要求1所述的一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，其特征在于，所述基因敲除靶序列應設在起始密碼子附近或其下游的外顯子區域，靶序列一般由19個堿基構成，靶序列前面必須是堿基G作為轉錄的起始信號，而靶序列后面的PAM序列必須是NGG，且靶序列必須具有唯一性。3.根據權利要求1所述的一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，其特征在于，將所述構建好的載體質粒DNA利用農桿菌感受態EHA105轉化到農桿菌，并抽質粒驗證表達載體的目的片段。4.根據權利要求1所述的一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，其特征在于，所述粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉化的受體材料，用農桿菌介導法實現遺傳轉化，獲得香味水稻植株。
【專利摘要】本發明公開了一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術分別將香味基因各個外顯子及內含子處能被Cas9識別的序列打靶，然后對基因組DNA序列切割后引發DNA修復，從而產生缺失突變，獲得功能缺失的Badh2基因。將秈稻、粳稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉化的受體材料：用成熟胚、幼穗和子房等為外植體誘導獲得二倍體愈傷組織，用農桿菌介導法將打靶載體導入愈傷組織細胞，篩選、鑒定陽性植株，從T1群體分離得到香稻品系；用花藥、花粉和未受精子房等為外植體誘導獲得單倍體愈傷組織，用農桿菌介導法將打靶載體導入到愈傷組織的細胞中，篩選陽性愈傷，用秋水仙素加倍，分化成苗，鑒定遺傳轉化陽性植株，最終得到香稻品系。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/82
【公開號】CN105505979
【申請號】CN201510856814
【發明人】居超明, 鄧燕, 徐國成, 吳文華
【申請人】湖北大學
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年11月28日