Stat1重組表達質粒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體地說，是一種Statl重組表達質粒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] St曰tl(signal transducers and activators of transcription 1，信號牽專導及 轉錄活化因子1)是細胞因子/生長因子信號轉導中中藥的胞質轉錄因子。S化tl有兩個亞型 (Statla和Static)，Statla有兩個憐酸化位點（Tyr 701和Ser 727)，它的剪輯變體Static 有一個憐酸化位點（Ser 727)。Statl與受體結合從而被憐酸化，激活的Statl轉移到核內激 活祀基因的轉錄，從而在多種腫瘤中發揮作用。
[0003] 中國專利201310612966.6公開了一種重組載體及其制備方法和應用，其采用酵母 分泌表達載體pPICZaA構建，含有人源CTLA4胞外區基因，可用于表達人源CTLA4融合蛋白； 該重組載體還含有Kex2蛋白酶酶切位點、Hi S標簽和c-myc標簽，可使得表達的CTLA4融合蛋 白W分泌蛋白的形式釋放到胞外，并對蛋白進行純化，為CTLA4蛋白的工業化生產提供了一 種簡便的方法。中國專利2013105616301公開了一種帶Myc標簽的LAMP1真核表達載體及其 應用，其通過將LAMP1基因與Myc標簽蛋白基因構成融合基因，利用載體上的啟動子和信號 序列來控制融合基因的表達，然后采用免疫沉淀的方式分離溶酶體，操作簡便，富集效率 高，結果易于檢測，成本低，可應用于高效的分離溶酶體。中國專利201310750733.2公開了 一種通用型重組表達載體，該表達載體攜帶有多功能標簽的編碼基因，所述多種功能標簽 為化3，(3-1117(3，門曰旨，齡，651'和6。?標簽中的至少一種;其還提供了一種通用型重組表達載體 的構建方法和應用，所述構建方法，簡單，制備成本低，可用于外源蛋白的生產，便于目的蛋 白的表達、檢測、示蹤和純化。但是關于本發明的pS化tla/0-myc/GFP重組質粒，目前還未見 報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供重組質粒pStatla-myc和pStatlP-myc。
[000引本發明的再一的目的是，如上所述重組質粒的制備方法。
[0006] 本發明的另一的目的是，提供重組質粒pS化tla-GFP和pS化tlf3-GFP。
[0007] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：
[000引重組質粒 pStatla-myc 和 pSl:atl0-myc，所述重組質粒 pSl:atla-myc 和 pSl:atl0-myc 是通過將PCR擴增的基因片段Statla和Static插入到載體pcDNA4/T0/myc-His酶切位點Κρη I和Sac II中制備得到的。
[0009] 所述基因片段StaUa是采用如下引物擴增得到的：
[0010]
[0013] 為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是：
[0014] 如上所述重組質粒pS化tla-myc和pS化tl0-myc的制備方法，包含如下步驟：
[001引 1 )PCR擴增獲得Statl基因；
[0016] 2)將含有myc-His6片段的載體與步驟1)獲得的含statla和static基因的PCR產物 酶切，酶切回收的產物采用T4DNA連接酶連接；
[0017] 3)將步驟2)獲得的連接產物轉化感受態細菌；
[0018] 4)鑒定陽性克隆，將測序正確的克隆利用無內毒素質粒大提試劑盒進行質粒的大 量制備。
[0019] 所述步驟1)中的PCR擴增使用的PCR引物如下：
[0020]
[0021] 。
[0022] 所述步驟2)中含有myc-His6片段的載體為質粒pcDNA4/T0/myc-His。
[0023] 所述步驟2)中采用Κρη I和Sac II對PCR產物和載體進行雙酶切，具體酶切反應體 系如下：10x Buffer 6μ1，Κρη巧日Sac II各祉1，模板(PCR產物或質粒)祉g，再用去離子水 補足至60μ1。
[0024] 為實現上述第Ξ個目的，本發明采取的技術方案是：
[002引重組質粒pStatie-GFP和pS化tie-GFP，所述重組質粒pS化tla-GFP和pS化tie-GFP 是通過如下方法制備得到的：將如上所述的重組質粒pStatla-myc和pStatl0-myc通過酶 切，再將獲得StaUa和Statl卵每切片段插入祀GFP-N1的酶切位點Bgl II和Sac II中制備獲 得。
[0026] 所述插入祀GFP-Nl中的含有Statla和Static的的基因片段是使用限制性內切酶 Bgl II和Sac II對質粒pS化tla-myc和pS化tl0-myc進行雙酶切制備得到的。
[0027] 本發明優點在于：
[0028] 本發明建立Statl兩個亞型α和β的真核表達質粒，其中一組是帶有myc和his蛋白 標簽的重組質粒，可W用于研究細胞內和Statla/Statie直接相互作用的蛋白或者核酸分 子的功能；另一組是帶有巧光蛋白GFP的重組質粒，可W研究Statla/StatlP蛋白在細胞內 的定位;本發明的重組質粒可用于研究Statl的兩個不同亞型α和β在正常細胞和腫瘤細胞 的增殖、遷移和侵襲的作用，也可用于研究蛋白和蛋白之間的相互作用，具有潛在的臨床應 用價值。
【附圖說明】
[0029] 附圖1為Statl四個重組質粒的質粒圖譜，其中a、b、c、d依次為pStatla-町C、 pStatl0-myc、pStatla-GFP 和 pSl:atl0-GFP。
[0030] 附圖2為瓊脂糖凝膠電泳結果，其中a為連接前質粒載體和PCR產物雙酶切結果，b 為單克隆擴大培養后提取質粒雙酶切鑒定結果。
[0031] 附圖3為293T細胞的質粒轉染，蛋白印跡法結果。
[0032] 附圖4為祀GFP、pS化tla-GFP和pS化tie-GFP質粒在293T中的表達結果。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合【具體實施方式】，進一步闡述本發明。應理解，運些實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明記載的內容之后，本領域技 術人員可W對本發明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所 限定的范圍。
[0034] 實施例1
[0035] 1試驗材料
[0036] 卵巢癌細胞系(ATCC號:HTB-161)、總RNA提取試劑盒(A巧gen AP-MN-MS-RNA-50)、 反轉錄試劑盒（Roche 04897030001)、高保真酶PrimeSTAR Max DNA 化lymerase(Takara R045A)、限制性內切酶Κρη I(Invitrogenl5232-010)、Sac iKlnvi化ogen 15240-901)、 BglIIαnvitrogenl5213-010)、PCR產物回收試劑盒(A巧genAP-PCR-50)、DNA凝膠回收 試劑盒（Axygen AP-GX-50G)、T4DNA連接酶（Invitrogen 15224-017)、感受態細胞DH5a (Tiangen CBlOl)、無內毒素質粒大提試劑盒（Tiangen DP117)、pcDNA4/T0/myc-His(B) (Invitrogen V1030-20)和pEGFP-Nl(Clontech)。
[0037] 化 Stat]_a-myc 和 pSl:atl0-myc 質粒的構建 [003引2.1引物設計
[0039] 從Genbank數據庫中下載人的Statl的mRNA序列，其中alpha(a)亞型為匪_ 〇〇7315.3,661日(0)亞型為匪_139266.2。再結合真核表達質粒9。〇麻4/1'〇/1117(3-化3(8)和 pEGFP-Nl的多克隆酶切位點的序列，自行設計合成了擴增Statl兩個亞型CDS區的引物。擴 增引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列見表1。
[0040] 表1擴增StaUa和static全長CDS的引物序列
[0041]
[0042] 2.2細胞培養、總RNA提取
[0043] 將人的卵巢癌細胞系0VCAR-3(ATCC號:HTB-161)按照10~6個細胞接種于T25細胞 培養瓶。待細胞生長融合至80%-90%時，棄掉培養基上清，使用無菌的PBS清洗兩次，然后 盡量去除PBS，采用Axygen總RNA提取試劑盒(Axygen AP-MN-MS-RNA-50)裂解細胞提取獲得 細胞總RNA。具體步驟如下：
[0044] 1)將60化1的裂解液buffer R-I加入細胞表面并用槍頭吹打8~10次，轉移裂解的 細胞于無 RNA酶的離屯、管中；
[004引 2)使用21-25號針頭的注射器抽吸8~10次，充分裂解細胞，加入22化1 buffer R-Π ，震蕩混勻30s;4°C離屯、12000g離屯、lOmin;
[0046] 3)吸取上清液于新的無 RNA酶的離屯、管，加入40化1異丙醇充分混勻；
[0047] 4)用柱子吸附 RNA，6000g 離屯、Imin;
[004引 5)加入buffer W1A溶液500yl，12000g離屯、Imin，清洗一次；
[0049]