一種具有高效同源重組能力的土曲霉及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種具有高效同源重組能力的土曲霉及其構建方法與應用，屬于基因 工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 土曲霉是一種重要的絲狀真菌，能夠產生多種有價值的化合物，包括有機酸、酶 類、脂類以及具有生物活性的次級代謝產物。其中衣康酸和洛伐他汀已經實現工業化生產， 具有很大的市場。隨著分子生物學的不斷發展，通過代謝工程對生產菌株進行改造，提高目 標產物的生產水平，具有非常重要的意義。
[0003] 基因打靶技術是現代分子生物學的一個重要研宄手段，通常是指含已知序列的 DNA片段與受體細胞基因組發生同源重組，整合至細胞受體基因組中，在特異性靶位點上增 加外源DNA片段，或者刪除靶位點之間DNA片段的技術。它可以實現基因敲除、目的基因定 點過表達、基因替換和啟動子替換等多種遺傳改造策略。因此，基因打靶技術在功能基因組 學以及菌株的基因工程改造研宄中發揮著至關重要的作用。在生物體內DNA雙鏈斷裂修 復的方式有兩種，即同源重組途徑和非同源末端連接途徑（Non-homologous End Joining， NHEJ)。在絲狀真菌中，DNA雙鏈斷裂修復主要依靠非同源末端連接途徑，從而導致外源DNA 主要以隨機插入方式整合到基因組上，同源重組效率低下，使得基因打靶技術的應用受到 了嚴重制約。有研宄顯示失活同源重組途徑可以提高外源DNA隨機插入整合的效率，失活 非同源末端連接途徑則能顯著提高外源DNA以同源重組方式整合到基因組上的概率。
【發明內容】
[0004] 為解決土曲霉菌的同源重組能力低導致基因打靶技術在土曲霉遺傳改造領域中 應用受到限制的技術問題，本發明提供了一種具有高效同源重組能力的土曲霉及其構建方 法與應用，所采取的技術方案如下：
[0005] 本發明的目的在于提供一種具有高效同源重組能力的土曲霉及其構建方法與應 用，該方法是以土曲霉Aspergillus terreus為出發菌，通過敲除ku80基因或lig4基因提 高外源DNA的同源重組概率。
[0006] 優選地，所述方法是擴增出ku80基因或lig4基因的上游序列U和下游序列D以 及篩選標記基因，再通過融合PCR技術將篩選標記基因分別與上游序列U和下游序列D進 行融合，獲得融合產物A和融合產物B，再分別以融合產物A和融合產物B為模板，擴增出打 靶元件A和打靶元件B，再將打靶元件轉化到土曲霉原生質體中培養，最后通過篩選獲得敲 除ku80基因或lig4基因的土曲霉重組菌。
[0007] 所述打靶元件A和打靶元件B，分別含有一段不完整且部分重疊的篩選標記基因 片段，這兩個不完整的篩選標記片段于重疊部分發生同源重組可以組合成一個完整的篩選 標記基因，
[0008] 所述出發菌，是土曲霉CICC40205。
[0009] 優選地，所述方法的步驟如下：
[0010] 1)以土曲霉的基因組為模板，通過PCR擴增ku80基因或lig4基因的上游序列U 和下游序列D，以質粒pPTR II為模板通過PCR擴增篩選標記基因 ptrA ;
[0011] 2)通過融合PCR技術將步驟1)所得篩選標記基因 ptrA分別與上游序列U和下游 序列D融合，獲得融合產物A和融合產物B ;
[0012] 3)再分別以步驟2)所得的融合產物A和融合產物B為模板，通過PCR擴增出打靶 元件A和打靶元件B，打靶元件A包括上游序列U和ptrA篩選標記的5'端部分序列，打靶 元件B包括ptrA篩選標記的5'端部分序列和下游序列D，打靶元件A的5'端和打靶元件 B的3'端ptrA序列有重疊部分，該重疊部分長度為300-800bp ;
[0013] 4)制備土曲霉原生質體，再將步驟3)獲得的打靶元件A和打靶元件B轉化到土曲 霉原生質體中培養，獲得轉化子；
[0014] 5)篩選步驟4)中敲除ku80基因或lig4基因的轉化子，獲得同源重組能力提高的 土曲霉重組菌。
[0015] 更優選地，所述方法的步驟如下：
[0016] 1)以土曲霉NIH2624的基因組為模板，通過PCR擴增ku80基因的上游序列U-ku80 和下游序列D-ku80,以質粒pPTR II為模板通過PCR擴增篩選標記基因 ptrA ;
[0017] 2)通過融合PCR技術將步驟1)所得篩選標記基因 ptrA分別與上游序列U-ku80 和下游序列D-ku80融合，獲得融合產物A和融合產物B ;
[0018] 3)再分別以步驟2)所得的融合產物A和融合產物B為模板，通過PCR擴增出打靶 元件ku80_A和打祀元件ku80_B，打祀元件ku80_A包括上游序列U_ku80和ptrA篩選標記的 5'端部分序列，打靶元件ku80-B包括ptrA篩選標記的5'端部分序列和下游序列D-ku80， 打靶元件ku80-A的3'端和打靶元件ku80-B的5'端ptrA序列有重疊部分，該重疊部分長 度為597bp ;
[0019] 4)制備土曲霉原生質體，再將步驟3)獲得的打靶元件A和打靶元件B轉化到土曲 霉原生質體中培養，獲得轉化子；
[0020] 5)最后通過吡啶硫胺抗性篩選步驟4)所得轉化子，再通過基因組驗證獲得敲除 ku80基因的重組菌At_Aku80。
[0021] 所述方法中所述擴增，擴增U-ku80的引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所 示；擴增D-ku80的引物序列如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示，擴增篩選標記基因 ptrA的 引物序列如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所示；擴增打靶元件ku80-A的引物序列如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 8所示，擴增打靶元件ku80-B的引物序列如SEQ ID NO. 9-SEQ ID NO. 10 所示。
[0022] 更優選地，所述方法的步驟如下：
[0023] 1)以土曲霉NIH2624的基因組為模板，通過PCR擴增lig4基因的上游序列U和下 游序列D，以質粒pPTR II為模板通過PCR擴增篩選標記基因 ptrA ;
[0024] 2)通過融合PCR技術將步驟1)所得篩選標記基因 ptrA分別與上游序列U-lig4 和下游序列D-lig4融合，獲得融合產物A和融合產物B ;
[0025] 3)再分別以步驟2)所得的融合產物A和融合產物B為模板，通過PCR擴增出打 革巴元件Iig4-A和打祀元件Iig4-B ;打祀元件Iig4-A包括上游序列U-lig4和ptrA篩選 標記的5'端部分序列，打靶元件Iig4-B包括ptrA篩選標記的5'端部分序列和下游序列 D-lig4,打靶元件Iig4-A的5'端和打靶元件Iig4-B的3'端ptrA序列有重疊部分，該重 疊部分長度為597bp ;
[0026] 4)制備土曲霉原生質體，再將步驟3)獲得的打靶元件A和打靶元件B轉化到土曲 霉原生質體中培養，獲得轉化子；
[0027] 5)最后通過吡啶硫胺抗性篩選步驟4)所得轉化子，再通過基因組驗證獲得敲除 lig4基因的重組菌At-Δ lig4。
[0028] 所述方法中所述擴增，擴增U-lig4的引物序列如SEQ ID NO. Il-SEQ ID NO. 12所 示；擴增D-lig4的引物序列如SEQ ID NO. 13-SEQ ID NO. 14所示，擴增篩選標記基因 ptrA 的引物序列如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所示；擴增打靶元件Iig4-A的引物序列如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 8所示，擴增打靶元件Iig4-B的引物序列如SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 9所示。
[0029] 所述任一方法用于制備土曲霉重組菌以及制備出的土曲霉重組菌都在本發明的 保護范圍之內。
[0030] 本發明取得的有益效果：
[0031] 本發明提供的土曲霉重組菌株，具有外源DNA同源重組概率高的優點，使基因打 靶技術的應用效率得到提高，可以為在土曲霉中高效應用基因打靶技術進行遺傳改造提供 基礎支持。
[0032] 野生型土曲霉的同源重組概率只有10%，以土曲霉CICC 40205為出發菌，敲除 ku80基因，構建外源DNA同源重組概率提高的重組菌At- Δ ku80,改造前土曲霉CICC 40205 中外源DNA同源重組概率為10%，重組菌At-Aku80中外源DNA同源重組概率提高到 94. 7% ;以土曲霉CICC40205為出發菌，敲除lig4基因，構建外源DNA同源重組概率提高 的重組菌At-Alig4,改造前土曲霉CICC 40205中外源DNA同源重組概率為10%，重組菌 At-Δ lig4中外源DNA同源重組概率提高到100%。
【附圖說明】
[0033] 圖1為實施例1提供的土曲霉pdc基因敲除原理不意圖。
[0034] 圖2為敲除土曲霉CICC40205菌株pdc基因所得轉化子的基因組PCR驗證；
[0035] (圖A為引物hph-F/hph-R驗證結果，圖B為引物Updc-F/hph-R驗證結果， 圖C為引物hph-F/Dpdc-R驗證結果，圖D為引物pdc-F/pdc-R驗證結果；M為Ikb DNA ladder (TAKARA)，M2 為 200bp DNA ladder (TAKARA)，C 是 CICC40205 野生型菌株作為對照， 1-20為所獲得轉化子）。
[0036] 圖3為敲除ku80基因的打靶元件及其發生同源重組敲