一種海參多糖和海參膠原蛋白多肽的聯合制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種海參多糖和海參膠原蛋白多肽的聯合制備方法，屬于分離純化技術領域。
【背景技術】
[0002]海參(sea cucumber,holothurians)在我國約有140多種，其中可供食用者約有40多種，常見的食用海參有:仿刺參、玉足海參、梅花參、前參、黑乳參、花刺參、糙海參、方柱五角瓜參、海地瓜等。海地瓜俗稱海茄子，是我國20多種食用海參中的一種，但食用品質較差，是我國大宗低值海參品種，但與花刺參、梅花參等高品質可食用海參營養成分相似。
[0003]體壁是海參的主要食(藥)用部位，國內外學者對海參的研究發現，海參體壁營養非常豐富，干海參體壁的有機成分中蛋白質含量接近90%，富含人體所需氨基酸，同時，體壁還含有海參皂苷、多糖、糖蛋白、多種維生素及微量元素，不含膽固醇。國內外已有關于海參的多種活性物質抗癌、抗腫瘤、抗氧化、降血壓、免疫調節等作用的報道。
[0004]海參肽是指蛋白酶水解并分離提純后得到的小分子肽，此外，海參體內還含有神經肽、糖肽以及抗菌肽等多種活性肽。海參肽具有多種功效，如降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗疲勞、抗菌、提高免疫力、延緩衰老和抗氧化等諸多生理功能，對人體生理機能有著其他營養物質不可替代的作用。由于海參肽具有良好的溶解性、穩定性、低粘度性、易消化吸收、無抗原性、食用安全性等特殊的理化性質，因此，海參肽比其他普通海參制品有著更高的生物效價。
[0005]海參多糖是海參干體中除蛋白之外含量最高的有機物，現階段研究的海參多糖主要分兩種:海參硫酸軟骨素(SC-CHS)和海參巖藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)。巖藻聚糖硫酸酯是一類主要由巖藻糖及硫酸酯基團組成的多糖類物質，已被證實其具有多種生理活性，包括抗凝血與抗血栓、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節、抗炎、降血脂、抗氧化、胃保護作用等。海參巖藻聚糖硫酸酯的結構比同種海參硫酸軟骨素的結構要簡單，但具有抗破骨類細胞形成、免疫調節、抗氧化等活性較高。
[0006]目前，有采用化學法水解海參蛋白、也有采用酶解法，都是通過一步水解法進行單獨海參多肽或者海參多糖的提取，上述方法只能得到一種海參活性物質(或海參多肽或海參多糖)，其它有效的海參活性物質在提取的同時被浪費掉，并且得到的海參多肽為多種分子量混合的物質，因為具有活性的海參肽通常為二肽、三肽等小分子肽，其中的大分子量的海參肽不利于吸收;另外化學法水解海參蛋白在提取海參活性物質的同時容易產生有毒物質。同時，關于海參多糖提取方法的研究報道較多，但利用低值海參聯合制備幾種分子量的海參多糖和海參蛋白多肽的方法鮮有報道。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種原料利用率高、生產成本較低的低值海參多糖和海參蛋白多肽的聯產制備方法，它是以低值海參海地瓜為原料，主要通過溫和的二階段酶解處理方法，利用超濾膜分離技術分別得到海地瓜多肽混合液和海地瓜多糖混合液。再通過選用截留分子量不同的超濾膜，實現對海地瓜多肽和海地瓜多糖的分級分離，最終得到3種分子量的海地瓜蛋白多肽產品和4種分子量的海地瓜多糖產品。
[0008]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
具體方法包括如下:
(I)預處理。海地瓜干品用30-50°C清水泡發24-36小時，洗凈體表與體內的泥沙、淤泥，切碎成塊狀，置于40-50°C烘箱中烘至恒重，粉碎至60-100目顆粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存備用。
[0009](2)酶解。海地瓜干粉加入純凈水，料液比為1:30-1:80(W/W)。采用不同的酶和水解條件進行二階段酶解:用堿調PH至6.8-8.5，加入復合蛋白酶I，溫度40-60°C，保溫振蕩水浴酶解1-4小時；用酸調整pH至4.0-7.0，加入復合蛋白酶Π，溫度40-60°C，保溫振蕩水浴酶解2-5小時。酶解結束后加熱滅酶，抽濾除雜，得酶解液待用。
[0010](3)超濾膜分離。將步驟(2)中獲得的海地瓜酶解液在優化的超濾條件下，選用截留分子量為1KDa超濾膜進行超濾分離，透過液為海地瓜多肽混合液，截流液為海地瓜多糖混合液。
[0011](4)海地瓜多肽的分級分離。在超濾條件下，選用截留分子量為5 KDa和I KDa的超濾膜，依次對步驟(3)中獲得的分子量在10 KDa以下的海地瓜多肽混合液進行超濾分級分離，采用截留液全循環超濾方式，當截留液體積為原始酶解液體積的1/5時，達到超濾終點。依次收集5 KDa截留液、I KDa截留液和I KDa透過液，透析除鹽，旋轉蒸發后，冷凍干燥得到3個海地瓜多肽產品PlP^P3,其分子質量范圍分別是5?10 KDa.l-5 KDa和<1 KDa;所占比例12.46%、P2 為 39.07%、P3 為 48.47%。
[0012](5)海地瓜多糖的分級分離。在超濾條件下，選用截留分子量為10 KDaUOO KDa和200 KDa的超濾膜對步驟(3)獲得的海地瓜多糖混合液進行截留液全循環超濾，當截留液體積為原始酶解液體積的1/5時，達到超濾終點。依次收集10 KDa透過液、100 KDa透過液、200KDa透過液和200 KDa截留液，透析除鹽，旋轉蒸發后，冷凍干燥得到4個海地瓜多糖產品G1、G2、G3和G4，其分子質量范圍分別是<10 KDa^lO-1OO KDa^ 100-200 KDa和>200 KDa，所占比例:Gi 為 3.67%、G2 為 19.36%、G353.09%、G4 為 23.88%。
[0013]在步驟(2)中，所用的復合蛋白酶I為:胰蛋白酶和堿性蛋白酶，兩者重量比為2:1，復合蛋白酶I的添加量為原料重量的0.2-3%。所用的復合蛋白酶Π為:木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，三者的重量比為3:1:1,復合蛋白酶Π的添加量為原料重量的0.5-4%。
[0014]在步驟(3)、步驟(4)、步驟(5)中，所述的超濾條件:操作壓力為0.05-1.0 MPa，操作溫度為25-45°C。
[0015]在步驟(4)、步驟(5)中，所述的旋轉蒸發溫度為40_60°C.由于本發明根據低值海參海地瓜所含膠原蛋白和多糖等的特性，改變傳統的分別提取提取的方法，采用不同的水解酶和水解條件對海地瓜進行二階段酶解，選用不同截留分子量的超濾膜，對不同分子量的海參多肽和多糖逐步分級分離，實現了不同分子量的海參多肽和多糖產品聯合制備。1、本發明利用低值海參海地瓜為原料，提高了原料利用價值。2、本發明通過聯產方法使海地瓜中不同分子量的海參多肽和多糖產品可以聯合制備，減少提取過程廢棄物的排放，降低生產成本。3、本發明制備的多種不同分子量的海參多肽和多糖產品可以滿足不同需求，應用范圍廣。
【具體實施方式】
[0016]本發明用下列實施例來進一步說明本發明，但本發明的保護范圍并不限于下列實施例。
[0017]實施例1
(I)預處理。海地瓜干品用30°c清水泡發24小時，洗凈體表與體內的泥沙、淤泥，切碎成塊狀，置于40°C烘箱中烘至恒重，粉碎至60目顆粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存備用。
[0018](2)酶解。將10g海地瓜干粉加入500g純凈水，料液比為1:50(W/W)，用堿調pH至7.5，加入0.6g胰蛋白酶和0.3g堿性蛋白酶，在45°C，保溫振蕩水浴酶解4小時；用酸調整pH至6.5，加入0.3g木瓜蛋白酶、0.1g中性蛋白酶和0.1g胃蛋白酶在45°C，保溫振蕩水浴酶解5小時。酶解結束后加熱滅酶(100°C，1min)，抽濾除雜，得酶解液470ml待用。
[0019](3)超濾膜分離。將步驟(2)中獲得的470ml海地瓜酶解液用截留分子量為1KDa超濾膜進行超濾分離，超濾條件:操作壓力為0.2 MPa，操作溫度為35°C。得到:375 ml透過液，此為海地瓜多肽混合液；95ml截流液，此為海地瓜多糖混合液。
[0020](4)海地瓜多肽的分級分離。選用截留分子量為5 KDa和I KDa的超濾膜，依次對步驟(3)中獲得的375 ml分子量在10 KDa以下的海地瓜多肽混合液進行超濾分級分離，超濾條件:操作壓力為0.2 MPa，操作溫度為35°C。采用截留液全循環超濾方式，當截留液體積為原始酶解液體積的1/5時，達到超濾終點。依次收集5 KDa截留液75ml、I KDa截留液60ml和IKDa透過液240ml。透析除鹽，40°C旋轉蒸發后，冷凍干燥得到3個海地瓜多肽產品，其分子質量5-10 KDa的多肽7.23g、l-5 KDa的多肽22.87g、小于I KDa多肽28.50g;海參多肽的總量58.60g，各分子質量多肽所占比例:5-10 KDa的多肽12.34%、1-5 KDa的多肽39.03%、小于IKDa多肽48.63%。
[0021 ] (5 )海地瓜多糖的分級分離。將對步驟(3)中截留的95ml分子量在10 KDa以上的海地瓜多糖混合液，用純凈水定容至300ml，選用截留分子量為200 KDa.lOO KDa和10 KDa的超濾膜對海地瓜多糖混合液進行截留液全循環超濾，超濾條件:操作壓力為0.2 MPa，操作溫度為35°C。當截留液體積為多糖混合液體積的1/5時，達到超濾終點。依次收集200KDa截留液60ml、100 KDa截留液48ml、10 KDa截留液40ml和10 KDa透過液152ml。透析除鹽，50°C旋轉蒸發后冷凍干燥得到4個海地瓜多糖產品，其分子質量大于200 KDa的多糖2.75g，100-200 KDa的多糖6.llg，10-100 KDa的多糖2.23g，小于1KDa的多糖0.42g;海參多糖的總量
11.51g，各分子質量多糖所占比例:大于200 KDa的多糖23.89%，100-200 KDa的多糖53.08%，10-100 KDa的多糖 19.37%，小于1KDa的多糖3.65%。
[0022]實施例2
(I)預處理。海地瓜干品用50°C清水泡發36小時，洗凈體表與體內的泥沙、淤泥，切碎成塊狀，置于50°C烘箱中烘至恒重，粉碎至100目顆粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存備用。
[0023](2)酶解。將10g海地瓜干粉加入600g純凈水，料液比為1:60(W/W)，用堿調pH至8.0，加入0.8g胰蛋白酶和0.4g堿性蛋白酶，在50°