快速區分仿刺參來源地的隨機擴增多態性dna方法及實現所述方法的引物的制作方法
【專利說明】快速區分仿刺參來源地的隨機擴増多態性DNA方法及實現所 述方法的引物 【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，涉及海參的分子生物學鑒定，特別是通過隨機擴增 多態性DNA對三種不同來源地的仿刺參進行快速鑒定的方法。 【【背景技術】】
[0002] 海參是棘皮動物門海參綱動物的統稱，是名貴海味并具有重要的藥用價值。其中， 仿刺參(Aposti chopus japonicus)俗稱遼參，屬于楣手目、刺參科、仿刺參屬，是我國經濟 價值最高的海參品種。種群主要分布于遼、冀、魯、蘇等北方沿岸淺海區，在日本北海道、俄 屬海參崴、朝鮮半島也有生長。然而，商業利益也催生了如摻假、造假等不法行為，特別是譬 如偽造產地、以次充好等，所以對市面上所銷售種類繁多的海參進行物種分類和來源地鑒 定勢在必行。
[0003] 目前，鑒定海參種類及產地的方式主要有形態學鑒定、物理學方法鑒定、化學方法 鑒定以及分子生物學方法鑒定。其中傳統鑒定方法過程繁瑣復雜、耗時耗力、準確性低，難 以適應現代工業的鑒定要求。
[0004] 分子生物學方法以核酸為研究對象，具有特異性好、靈敏度高、耐熱性強等優點， 利用DNA條形碼技術對海參物種進行鑒定，例如線粒體細胞色素 c氧化酶亞基I (Mitochondrial cytochrome coxidase subunitI，C0I)由于存在顯著的序列變異而被認 為是一種合適的DNA分子標記。
[0005] 例如中國專利申請CN 201410010808.8公開了一種刺參科17種經濟海參基于⑶I 基因的PCR-RFLP鑒別方法，其通過分子生物學方法基于C0I基因對樣品基因片段進行PCR-RFLP反應，結合電泳檢測和譜帶判斷海參樣品的品種。然而，該方法只能檢測海參的品種， 而對于同品種的海參卻無法分辨其來源地。
[0006] 至于海參產地的鑒別研究，現代技術利用近紅外光譜法、ICP-MS進行研究，但上述 方法的特點是操作復雜，成本較高，且一般實驗室難以開展，故亟需發明一種簡單易行且準 確的鑒定方法。
[0007] 隨機擴增多態性DNA(randomly amplified polymorphic DNAJAFO)技術是由美 國科學家WilliamS、WelSh等于1990年提出的一項DNA多態性分析技術。其原理是采用短的 單一引物，一般約為10個堿基，通過PCR反應對目標生物的基因組DNA進行擴增，然后用聚丙 烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物，產物的電泳條帶在數量、大小位置、明暗等方面表 現出很強的特異性，反映出目標生物基因組DNA的多態性。 【
【發明內容】
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[0008] 本發明的目的是對來自大連、威海和煙臺的仿刺參進行快速來源地檢測。
[0009] 為了實現上述目的，本發明提供對仿刺參進行RAPD擴增的引物，所述引物序列如 SEQ No.l 所示。
[0010] 本發明還提供含有上述引物的快速檢測仿刺參來源地的試劑盒。
[0011] 本發明還涉及采用隨機擴增多態性DNA的快速區分仿刺參來源地的檢測方法，包 括以下步驟：
[0012] (1)對每一份仿刺參分別取待測樣品，提取DNA模板；
[0013] ⑵分別以待測樣品DNA為模板，如SEQ No.l所示的引物D20為隨機引物進行PCR反 應；
[0014] (3)對PCR反應產物進行電泳凝膠檢測；
[0015] (4)采用Ntsys軟件對電泳凝膠檢測所得擴增圖譜進行數據統計，將圖譜中的無條 帶位點負值為〇,有條帶位點賦值為1，通過Ntsys軟件計算各個樣品之間的遺傳相似系數矩 陣并進行聚類分析，得到各樣品的遺傳距離聚類圖；
[0016] (5)通過遺傳距離聚類圖區分仿刺參樣品的來源地。
[0017] 其中，步驟（1)包括待測樣品置于超純水中浸泡4-10小時，然后稱取80mg海參肌肉 柱，沖洗干凈后置液氮中研碎，取30mg的肌肉柱利用Mollusc DNAkit提取海參基因組DNA， 置4°C備用。
[0018] 步驟(2)的PCR反應條件為：
[0019] 反應體系：l〇XPCR Buffer 5yL，2.5mmol/L dNTPs 4yL，5U/yL Taq 酶 0·5μL，10μ mo 1/L 引物 2yL，DNA 模板 2yL，ddH20 補足至 50yL;
[0020] PCR反應參數:95°C預變性5min，然后經過40個循環，每個循環包括:95°C lmin，45 °C lmin，72°C2min;最后 72°C 延伸 lOmin，4°C 保存。
[0021 ] 步驟(3)包括以0.5 X TBE緩沖液配置1.5 % (w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱溶解，冷卻 至60°C左右時加入10% (v/v)核酸染料，混勻后倒入膠槽中，待膠凝固后，移去梳子，將膠放 入含0.5 X TBE緩沖液的電泳槽中；再將8yL步驟(2)的PCR產物與lyL加樣緩沖液混勻，依次 加入加樣孔內；控制電壓保持在ΙΟΟν電泳，當溴酚藍條帶泳動到2/3膠長時，停止電泳，取出 置于紫外凝膠成像系統中觀察。
[0022]步驟（4)中米用非加權組平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)進行聚類分析，構建各樣品的遺傳距離聚類圖。
[0023]與現有技術相比，本發明通過RAPD技術實現多種、多份仿刺參樣品來源地的快速 區分，克服了現有技術鑒定仿刺參時存在的成本高、費時長等缺點。本發明可快速分辨大 連、威海、煙臺的仿刺參，具有低成本、靈敏度高的優點。 【【附圖說明】】
[0024] 圖1為隨機序列C11擴增產物凝膠電泳結果；
[0025] 圖2為隨機序列C15擴增產物凝膠電泳結果；
[0026] 圖3為隨機序列C16擴增產物凝膠電泳結果；
[0027] 圖4為隨機序列D16擴增產物凝膠電泳結果；
[0028]圖5為隨機序列D20擴增產物凝膠電泳結果；
[0029] 其中：1 :Marker(2000bp); 2-10大連仿刺參；11-20煙臺仿刺參；21-28威海仿刺參； 29:Marker(2000bp)。
[0030]圖6為根據圖5的數據統計得到的不同來源地仿刺參的遺傳相似系數矩陣得到的 圖譜。 【【具體實施方式】】
[0031]以下通過較優實施例非限制性地解釋本發明的技術方案。
[0032] 實施例1
[0033] (1)海參樣品的預處理及品種確認
[0034] 分別購買來源地為大連的仿刺參9個、煙臺的仿刺參9個和威海的仿刺參8個共計 26個，順序編號，分別在Mi 11 i-Q超純水中浸泡5小時，備用。
[0035] 分別取肌肉柱30mg，在如下反應條件和反應體系下以海參種特異性引物進行PCR 反應：
[0036]
[0051] 8.將柱子放回同樣的收集管，在把剩余的液體加入，同上離心放棄液體；
[0052] 9.放柱子在2ml的新收集管用500yL HB buffer洗，lOOOOXg離心30s，放棄液體， 取柱子；
[0053] 10.放置柱子到2ml的離心管加 700yL DNA Wash buffer(提前用酒精稀釋），10000 X g離心lmin，棄液體；
[0054] 11.重復第九步，再用700yL DNAWash buffer洗。然后將柱子放到空收集管中 15000g 離心 2min;
[0055] 12