專利名稱：香菇菌株鑒別的特征引物和方法
技術領域：
本發明屬于利用分子生物學方法檢測鑒別食用菌菌株的技術領域。具體地說，是涉及一種用于鑒別香菇菌株的技術方法及其引物的設計和引物序列。
背景技術：
香菇是我國人工馴化栽培最早的大型真菌，2002年我國香菇產量占世界總產的80％，但是我國香菇菌種檢測技術滯后，菌種管理混亂，給育種者和生產者都帶來極大危害，制約著我國香菇出口。目前，我國香菇菌株鑒定常用的方法，主要是采用拮抗反應、酯酶同工酶技術和RAPD技術(隨機擴增多態性DNA分析)。這3種方法都曾發揮過重要的作用，但也有其缺點和缺陷性。
發明內容
本發明的目的是提供一種香菇菌株鑒別的技術。具體包括1.提供利用特征引物進行菌株鑒定的方法；2.提供用于香菇ISSR擴增的5`錨定的特征引物。
本發明的發明人在對香菇菌株鑒定的研究中發現，自行設計的特征引物能夠快速準確的對香菇菌株進行鑒別。
本發明的用于香菇菌株鑒別的特征引物序列為Primer 15`gtg acg act ctc tct ctct 3`。Primer 25`gga tgc aac aca cac aca c 3`。
本發明的特征引物能夠快速有效的鑒別香菇菌株。
本發明所提供的香菇菌株鑒別的方法采用下面所述的本發明的操作步驟、引物、反應體系及擴增程序，對香菇菌株進行鑒定。其他具體步驟和過程，按照常規的分子生物學方法進行。
本發明具有以下有益效果1.所提供的引物可以快速方便地將香菇菌株進行鑒別。
2.所提供的香菇菌株鑒定方法，采用ISSR技術，鑒別更加簡單化，通常只須少量樣品，不需大量提取DNA。
圖1Primer 1對香菇菌株的ISSR指紋圖譜1～17菌株編號，C陰性對照，M為λDNA/HindIII+EcoR I。
圖2Primer2對香菇菌株的ISSR指紋圖譜1～17菌株編號，C陰性對照，M為λDNA/HindIII+EcoR I。
具體實施例方式
以下通過實例對本發明作進一步說明實施例1 Primer 1和Primer 2的制備根據Primer 1和Primer 2的核苷酸序列，在商業化的DNA自動合成儀上進行化學合成，即可獲得Primer 15`gtg acg act ctc tct ctc t 3`。Primer 25`gga tgc aac acacac aca c 3`的核苷酸序列實施例2 香菇菌株的鑒別(1)DNA提取的具體步驟●液氮研磨0.2g菌絲，轉移到含有機溶劑的1.5ml的離心管中。
●加入預熱的0.6ml裂解液(100mM Tris-HCl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0；1.4M NaCl；2％CTAB；2％PVP；2％(V/V)的2-巰基乙醇)，充分混合，65℃溫浴60min，不時混勻。
●12,000r/min離心10min，取上清液。
●用等體積的1∶1苯酚/氯仿抽提，4℃，10,000r/min離心10min，回收上(水)相。
●用等體積的24∶1氯仿/異戊醇抽提，4℃，10,000r/min離心10min回收上(水)相。
●如果界面有明顯沉淀，則重復5～6，否則繼續下面步驟。
●加入2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，-20℃沉淀10min，4℃條件下8,000r/min離心10min收集沉淀。
●沉淀用70％的乙醇洗滌2-3次，倒置瀝干●加入100μl TE緩沖液溶解沉淀。
(2)PCR反應體系的總體積為25μl，組分見表2-9。陰性對照中用ddH2O代替模板。
ISSR的PCR擴增反應體系
(3)PCR程序預變性92℃，5min；變性92℃，30S；復性49℃，1min；延伸72℃，5min；30個循環。補平72℃，7min。
(4)取5ul產物于1.4％的瓊酯糖凝膠電泳，以λDNA/EcoTI+HindIII Marker為分子量標記。溴化乙錠染色，用凝膠成像儀記錄試驗結果。
從圖1和圖2的結果中可以清楚的看出采用Primer 1和Primer 2對香菇菌株進行ISSR，各引物均可以對香菇菌株進行鑒別。
權利要求
1.用于香菇ISSR擴增的5`錨定的引物，其特征是其核苷酸序列為Primer 15`gtg acgact ctc tct ctc t 3`或Primer 25`gga tgc aac aca cac aca c 3`。
2.一種香菇菌株鑒別的方法，其特征是采用權利要求1所述的引物，通過ISSR方法進行檢驗鑒定，具體步驟和過程按常規的分子生物學方法進行。
全文摘要
本發明屬于利用分子生物學方法檢測食用菌菌株的技術領域。本發明提供了香菇菌株鑒定的引物，以及利用該引物進行菌株鑒定的方法。利用本發明可方便、快速、準確地鑒別香菇菌株。
文檔編號C12Q1/68GK1772918SQ20041009276
公開日2006年5月17日 申請日期2004年11月8日 優先權日2004年11月8日
發明者張瑞穎, 張金霞, 黃晨陽 申請人:中國農業科學院土壤肥料研究所