一種鑒定新菠蘿灰粉蚧的引物對及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物檢疫技術領域，具體設及一種鑒定新渡蘿灰粉階的引物對及其應 用。
【背景技術】
[0002] 新渡蘿灰粉階（Dysmicoc州S neobrevipes Beardsley)屬半翅目巧emiptera)，階 總科(Coccoidea)，粉階科(Pseudococcidae)。
[0003] 新渡蘿灰粉階寄主范圍十分廣泛，危害渡蘿、香蕉、番慕枝、相橘、葡萄等農林經濟 作物，其主要分布在熱帶、亞熱帶地區，目前在我國僅海南、臺灣地區、廣東局部有分布記 載。新渡蘿灰粉階W卵、幼蟲和成蟲寄生在寄主植物表面，因而極易隨寄主植物傳播，被列 入中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄中，在口岸檢疫中常有截獲。
[0004] 新渡蘿灰粉階種類識別主要基于雌成蟲的外部形態特征，包括體長、多孔腺類型、 數量及排列，而運些識別特征對于口岸經常截獲的若蟲或殘體的鑒別則無能為力，且用傳 統形態分類進行階蟲鑒定過程復雜，需經固定、透明、染色、脫色、整形、封片、鏡檢等一系列 步驟，運與進口水果快速驗放、快速通關形成矛盾。因此，傳統的形態學方法難W滿足口岸 檢疫W及水果和種苗調運過程中對新渡蘿灰粉階快速識別與鑒定的現實需求，尤其當截獲 的樣本為若蟲或殘體時，而新渡蘿灰粉階的快速準確識別是有效阻止其進一步傳播擴散的 必要前提。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種鑒定新渡蘿灰粉階的引物對及其應用。
[0006] 本發明提供一種引物對，由引物D. ne〇-28SF和引物D. ne〇-28SR組成；
[0007] 所述引物D.ne〇-28SF為如下(al)或(曰2):
[000引（al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；
[0009] (a2)將序列1經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有 相同功能的DNA分子；
[0010] 所述引物D.ne〇-28SR為如下（日3)或(曰4):
[0011] (曰3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；
[0012] (a4)將序列2經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有 相同功能的DNA分子。
[0013] 所述引物對的用途為如下(bl)或化2)或化3)或化4):
[0014] (bl)鑒定或輔助鑒定待測昆蟲是否為新渡蘿灰粉階；
[0015] 化2)制備用于鑒定或輔助鑒定待測昆蟲是否為新渡蘿灰粉階的試劑盒；
[0016] 化3)檢測待測生物樣本中是否含有新渡蘿灰粉階；
[0017] 化4)制備用于檢測待測生物樣本中是否含有新渡蘿灰粉階的試劑盒。
[0018] 本發明還保護含有所述引物對的試劑盒;所述試劑盒的用途為如下(cl)或(c2):
[0019] (cl)鑒定或輔助鑒定待測昆蟲是否為新渡蘿灰粉階；
[0020] (c2)檢測待測生物樣本中是否含有新渡蘿灰粉階。
[0021] 本發明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。
[0022] 本發明還保護一種鑒定待測昆蟲是否為新渡蘿灰粉階的方法，包括如下步驟：
[0023] (1)提取待測昆蟲的基因組DNA;
[0024] (2)W步驟(1)提取的基因組DNA為模板，采用所述的引物對進行PCR擴增，如果PCR 擴增產物中含有23化P-24化P的DNA片段、待測昆蟲為或候選為新渡蘿灰粉階，如果PCR擴增 產物中不含有23化P-24化P的DNA片段、待測昆蟲為或候選為非新渡蘿灰粉階。
[00巧]所述23化P-24化P的DNA片段具體可為23化P的DNA片段。
[00%] 所述230bp-240bp的DNA片段具體可為如下（dl)或（d2):
[0027] (dl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；
[002引 （d2)與序列表的序列3具有95% W上同源性的DNA分子。
[0029] 本發明還保護一種鑒定待測昆蟲是否為新渡蘿灰粉階的方法，包括如下步驟：
[0030] 檢測待測昆蟲的基因組DNA中是否含有特異DNA片段，如果含有特異DNA片段、待測 昆蟲為或候選為新渡蘿灰粉階，如果不含有特異DNA片段、待測昆蟲為或候選為非新渡蘿灰 粉階；
[0031] 所述特異DNA片段為新渡蘿灰粉階的基因組中所述的引物對的祀序列。
[0032] 所述特異DNA片段具體可為如下(dl)或(d2):
[0033] (dl)序列表的序列3所示的單鏈DM分子；
[0034] (d2)與序列表的序列3具有95% W上同源性的DNA分子。
[0035] 本發明還保護一種檢測待測生物樣本中是否含有新渡蘿灰粉階的方法，包括如下 步驟：
[0036] (1)提取待測生物樣本的總DNA;
[0037] (2)W步驟(1)提取的總DNA為模板，采用所述的引物對進行PCR擴增，如果PCR擴增 產物中含有23化p-240bp的DNA片段、待測生物樣本中含有或疑似含有新渡蘿灰粉階，如果 PCR擴增產物中不含有230bp-24化P的DNA片段、待測生物樣本中不含有或疑似不含有新渡 蘿灰粉階。
[0038] 所述230bp-240bp的DNA片段具體可為23化P的DNA片段。
[0039] 所述230bp-240bp的DNA片段具體可為如下（dl)或（d2):
[0040] (dl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；
[0041 ] (d2)與序列表的序列3具有95% W上同源性的DNA分子。
[0042] 本發明還保護一種檢測待測生物樣本中是否含有新渡蘿灰粉階的方法，包括如下 步驟：
[0043] 檢測待測生物樣本的總DNA中是否含有特異DNA片段，如果含有特異DNA片段、待測 生物樣本中含有或疑似含有新渡蘿灰粉階，如果不含有特異DNA片段、待測生物樣本中不含 有或疑似不含有新渡蘿灰粉階；
[0044] 所述特異DNA片段為新渡蘿灰粉階的基因組中所述的引物對的祀序列。
[0045] 本發明還保護一種特異DNA片段，為新渡蘿灰粉階的基因組中所述的引物對的祀 序列。
[0046] 所述特異DM片段具體可為如下(dl)或(d2):
[0047] (dl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；
[004引 （d2)與序列表的序列3具有95% W上同源性的DNA分子。
[0049] W上任一所述昆蟲具體可為粉階。所述粉階具體可為新渡蘿灰粉階、杰克貝爾氏 粉階、大洋臀紋粉階、橘臀紋粉階、腺刺粉階、渡蘿灰粉階或李比利氏灰粉階。
[0050] W上任一所述"待測生物樣本中是否含有新渡蘿灰粉階"中的新渡蘿灰粉階可為 成蟲、若蟲或殘體。
[0化1] W上任一所述PCR擴增的反應體系中，引物D.ne〇-28SF的工作濃度為10皿ol/L，引 物D. ne〇-28SR的工作濃度為10皿ol/L。
[0052] W上任一所述PCR擴增的反應體系具體可為：Easy Taq Buffer(包含lOmmol/ LMgCl2)2.5liL，2.5皿ol/LdNTPMix1:ure化L，D.neo-28SF和D.neo-28SR各化L，EasyTaq 〇臟？〇171116腳30(51]/化）〇.2化1^，模板〇臟4化，(1地2〇12.化化。
[0化3] W上任一所述PCR擴增的反應程序具體可為:95°C預變性3min;94°C變性45s，60°C 退火lmin，72°C延伸Imin，運行35個循環；最后72°C延伸7min。
[0054] 本發明圍繞新渡蘿灰粉階極易隨植物產品及其苗木等的調運而傳播蔓延，對農林 業生產存在巨大威脅，卻難W進行快速準確鑒別的問題，采用特異性PCR的技術與方法，從 檢測監測的角度，研究其快速檢測技術，同時，W粉階科在口岸中經常截獲的其他屬種的6 種粉階等為對照，進行種特異性檢驗，W不同寄主水果或同一寄主水果但不同批次水果截 獲的新渡蘿灰粉階進行應用驗證。本發明建立的檢測方法能夠快速準確地判斷樣品是否為 新渡蘿灰粉階，該方法的建立為新渡蘿灰粉階快速檢測與準確識別提供了依據，為有效阻 截新渡蘿灰粉階在我國的進一步傳播擴散和危害提供了技術保障，為進出口安全提供了保 證。
【附圖說明】
[0055] 圖1為實施例3中特異性檢測對應的電泳圖。
[0056] 圖2為實施例4中通用性檢測對應的電泳圖。
[0057] 圖3為實施例5中靈敏度檢測對應的電泳圖。
【具體實施方式】
[0058] W下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設置Ξ次重復實驗，結果取平 均值。
[0059] 新渡蘿灰粉階:參考文獻:徐浪，余道堅，焦懿，等.新渡蘿灰粉階及其近似種的DNA 條形碼鑒定[J].植物檢疫，2013,27(3) :66-69.;公眾可W從廈口出入境檢驗檢疫局檢驗檢 疫技術中屯、獲得。
[0060] 杰克貝爾氏粉階:參考文獻:徐浪，余道堅，焦懿，等.新渡蘿灰粉階及其近似種的 DNA條形碼鑒定[J].植物檢疫，2013,27(3) :66-69.;公眾可W從廈口出入境檢驗檢疫局檢 驗檢疫技術中屯、獲得。
[0061 ]大洋臀紋粉階:參考文獻:徐浪，余道堅，焦懿，等.新渡蘿灰粉階及其近似種的DM 條形碼鑒定[J].植物檢疫，2013,27(3) :66-69.:公眾可W從廈口出入境檢驗檢疫局檢驗檢 疫技術中屯、獲得。
[0062] 橘臀紋粉階:參考文獻:倪興武，高泉準，余芳平，張振民，鄭萬里.2006.臺灣地區 水果果實上可能攜帶的害蟲.植物檢疫，20(3): 155~157.;公眾可W從廈口出入境檢驗檢 疫局檢驗檢疫技術中屯、獲得。
[0063] 腺刺粉階:參考文獻:倪興武，高泉準，余芳平，等.臺灣地區水果果實上可能攜帶 的害蟲[J].植物檢疫，2006，20(3): 155-157公眾可W從廈口出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫 技術中屯、獲得。
[0064] 渡蘿灰粉階:參考文獻:徐浪，余道堅，焦懿，等.新渡蘿灰粉階及其近似種的DNA條 形碼鑒定[J].植物檢疫，2013，27(3): 66-69公眾可W從廈口出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫 技術中屯、獲得。
[0065] 李比利氏灰粉階:參考文獻:徐浪，余道堅，焦懿，等.新渡蘿灰粉階及其近似種的 DNA條形碼鑒定[J].植物檢疫，2013,27(3) :66-69.;公眾可W從廈口出入境檢驗檢疫局檢 驗檢疫技術中屯、獲得。
[0066] 實施例1、引物設計
[0067] 進行大量序列分析、比對獲得了用于鑒定新渡蘿灰粉階的若干引物。將各個引物 進行預實驗，比較靈敏度、特異性等性能，最終得到用于鑒定新渡蘿灰粉階的一對引物。如 下所示：
[006引 D.ne0-28SF(序列表的序列1) :5'-CGTGTGCGCTCGACGGGGTT-3' ；
[0069] D.ne〇-28SR(序列表的序列2) :5'-CCGAAGCGAACGCCGCAA-3'。
[0070] 實施例2、檢測方法建立
[0071] 一、基因組DNA的提取
[0072] 參照TIA化mp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離屯、柱 型），提取基因組DNA，依次按照如下步驟進行：
[0073] 1、將待測粉階置于0.6mL的離屯、管中，加入0.4mL的純水，蓋緊蓋子，在圓周振蕩器 上震蕩15s，