一種用于乳腺癌診斷的miRNA標志物、其應用及診斷試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，設及一種用于乳腺癌診斷的miRNA標志物、其應用及診 斷試劑盒。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌目前是全球范圍內最常見、致死人數最多的惡性腫瘤之一，其發病率及死 亡率增長迅速。要降低乳腺癌病人的死亡率除了在病因預防上降低發病率外，提高早期診 斷水平和藥物治療的療效是兩個重要方面。然而，肺癌的早期診斷一直是一個世界性難題， 目前影像診斷(B超、鋼祀），化學診斷（癌反應，血清學和免疫學指標)及組織細胞學診斷是 腫瘤診斷的Ξ大支柱，前者在亞臨床期診斷上有很大局限性，后二者均W腫瘤標志物作為 觀察指標，可W比影像診斷更早發現腫瘤的存在，具有高效、高靈敏性、方便、標本易獲取及 創傷小等優點，因此，在乳腺癌早期診治研究中，篩選及鑒定高特異性的乳腺癌腫瘤標志物 一直是研究的重點和難點。
[0003] 所謂腫瘤標志物，是指在腫瘤發生和增殖過程中，由腫瘤細胞生物合成、釋放或者 是腫瘤與宿主相互作用而產生的一類物質，反映著腫瘤的存在和生長。我們可通過利用化 學、免疫、分子生物學等技術對血液或分泌物進行定性或者定量的檢測，通過對其分析，幫 助我們從正常組織中區別腫瘤或者測定腫瘤細胞核、細胞質W及對細胞膜上的特性進行分 析，W此作為辨別腫瘤細胞的標志。乳腺癌的發生與發展具有十分復雜的機制，其發病的最 初階段設及到許多乳腺癌相關基因及其表達的改變，在致癌因素的作用下患者體內可表達 多種粘附分子及其受體或配體，在腫瘤發展的不同時期其釋放標志物含量也不一樣。
[0004] 由于乳腺癌組織病理的多樣性、同種病理腫瘤細胞的異質性和腫瘤生物學行為的 復雜性及多態性，造成單一標志物檢測對乳腺癌的診斷價值有限，只能反映了疾病某些側 面的變化，國內外眾多學者傾向于篩選多種有價值的腫瘤標志物進行聯合檢測，W提高乳 腺癌診斷的陽性率。雖然聯合檢測優于單項檢測已成共識，但并非任意一種組合均能提高 臨床診斷的陽性率，在最佳組合上結論頗不一致，甚至出現相反的結果。因此，尋找一種高 靈敏度、高特異性、可實際應用于乳腺癌臨床診治的生物標志物已成為乳腺癌研究中亟待 解決的問題之一。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是:提供一種用于乳腺癌診斷的miRNA標志物。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下:一種用于乳腺癌診斷的miRNA 標志物，所述標記物包括 11111?-146日、11111?-155、11111?-21、11111?-222和11111?-339。
[0007] 在本發明的第二方面，提供了上述miRNA標志物在制備乳腺癌診斷試劑盒中的應 用。
[000引在本發明的第Ξ方面，提供了一種乳腺癌診斷試劑盒，其能夠測定組織中的1111尺- 146a、miR-155、miR-21、miR-222 和 miR-339 的含量。
[0009] 在本發明的一個優選例中，上述試劑盒含有miR-146a，miR-155，miR-21，miR-222 和miR-339的引物和探針。
[0010] 在本發明的一個優選例中，上述引物和探針針對的目標序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和沈Q ID NO.5所示。
[0011] 在本發明的一個優選例中，上述試劑盒中含有美國應用生物系統公司的引物探針 組合，其產品編號分別為000468、002623、000397、002276和002184。
[0012] 在本發明的一個優選例中，上述試劑盒中還含有內參RNU44。
[001引所述診斷試劑盒還可W包括PCR反應常用試劑，如Taq酶，逆轉錄酶，緩沖液， dNTPs，MgCl2和肥PC水等;還可W含有標準品和/或對照品。
[0014] 上述人類乳腺癌診斷試劑盒中優選的還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑 是定量PCR擴增試劑盒中常規使用的一些試劑，運些試劑的特性W及它們的配制方法均是 本領域技術人員所熟知的；所述的試劑例如(但不限于）：陰性對照品、陽性對照品；還可W 包括巧光定量PCR反應板、PCR反應板封口膜等。
[0015] 可使用本領域技術人員所熟知的多種技術(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印跡分 析，溶液雜交檢測等)測定相關miRNA在乳腺癌患者和健康人群中的水平;在本發明的具體 實施方案中，使用了定量PCR的方法。
[0016] 在本發明的第四方面，提供了上述肺癌診斷試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
[0017] (1)從待測試樣品中提取總RNA;
[0018] (2)將步驟(1)提取得到的總RNA使用miRNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，得到相 應的cDNA;
[0019] (3)將步驟(2)得到的cDNA進行實時巧光定量PCR，并WRNU44為內參，檢測結果W Act表示，其中 Act = CtmiRNA-CtRNU44 ;
[0020] (4)將得到的結果代入公式ο. 987+0.032a-0.084b-0.061C+0.045d+0.004e中，將 計算值與0.709比較，如計算值大于0.709，則判斷為乳腺癌;如計算值小于0.709，則判斷為 非乳腺癌。其中a代表miR-146a的Act值，其中b代表miR-155的Act值，其中C代表miR-21的 Act值，其中d代表miR-222的Act值，其中e代表miR-339的Act值。
[0021] 本發明的有益效果在于:發明人通過廣泛的文獻調研，從公開發表的文獻中篩選 出可能具有潛力的腫瘤標志物，并通過大量的實驗和分析，首次發現了對乳腺癌具有較高 診斷價值的生物標記物miR-146a、miR-155、miR-21、miR-222和miR-339五種miRNA;通過 miRNA標志物和診斷試劑盒的研制和應用，可W使得乳腺癌的診斷更加方便易行，為臨床醫 生快速準確掌握患者病情，為提高臨床治療效果奠定基礎，并為發現具有潛在治療價值的 新型小分子藥物祀標提供幫助。
【附圖說明】
[0022] 圖1為正常對照及乳腺癌組織中miRNA表達的R0C曲線圖。
[0023] 圖2為計算模型1所得預測概率的R0C曲線圖。
【具體實施方式】
[0024] 一、研究對象
[0025] 病例組為2009年2月至2012年12月在常州市第二人民醫院收集的96例乳腺癌病 例，均經病理組織學確診，手術前未經化放療。由于正常的醫療過程中無法取得健康女性的 乳腺標本，因此對照組采用同期的纖維囊性乳腺病患者的手術標本11例，取其中的正常組 織做為對照，按性別和年齡（±5歲）與病例進行頻數匹配。用于研究的樣本為同期收取，采 樣、分裝、保存條件均一，通過對樣品資料的整理。
[0026] 二、研究方法
[0027] (1)使用10%中性甲醒充分固定手術標本，脫水、石蠟包埋、切片、皿染色后，由病 理醫師對切片進行組織學診斷，確定腫瘤組織、正常組織區域，并進行標記。
[00%] (2)按照石蠟組織總RNA快速提取試劑盒（美國QIAGEN公司）說明書從石蠟組織中 提取總RNA。
[0029] (3)按照miRNA逆轉錄試劑盒(TaqMan microRNA反轉錄試劑盒，貨號NO. 1302146R， 美國ABI公司）說明書進行逆轉錄反應。反應總體積為15u 1 (總RNA加1，TaqMan MicroRNA Assay 3ul,核酸酶自由水4.16ul，RNase抑制劑0.19ul，緩沖液1.加1，]\11111:13(31'化日逆轉錄 酶 l.OOul 和 dNTP0.15ul)，在不同溫度下（16°(：，42°(：，85°(：，4°(：)進行不同時長（3〇1111113， SOmins，5mins，lOmins)反應。
[0030] (4)實時巧光定量PCR按照TaqMan試劑盒（TaqMan通用混合試劑盒11，貨號 NO. 121207，美國ABI公司）說明書進行。PCR擴增體系總體積為1 Oul，反應共40個循環。PCR反 應Ct值通過7900實時巧光定量PCR儀(美國ABI公司）測定，每個反應重復Ξ次，WRNU44為內 參。檢測結果W Act表示，其中Act = CtmiRNA-CtRNU44，Act值越大，表達量越低。
[00川 S、研究結果
[0032] 病例組 11111?-146日，11111?-155，11111?-21，11111?-222和11111?-339的水平顯著高于正常對照 組，具體數據如表1所示：
[0033] 表1:正常乳腺(NC)及乳腺癌(BC)組織中microRNA表達水平(Act，均值±標準差）
[0034]
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