過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及構建的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程及微生物發酵技術領域，具體是涉及一株過表達尿苷二磷酸 葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌基因工程菌及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(110?-8111(3〇86。5^(^11〇8。11〇巧138 6，1]6?38 6)在植 物、動物和細菌中廣泛分布，是一種與糖代謝密切相關的酶。它催化生成的尿苷二磷酸葡萄 糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，可作為葡萄糖基的供體，在細胞內作為蔗糖、淀粉、纖 維素、半纖維素、果膠質以及糖脂、糖蛋白、糖原、β-葡聚糖等多種碳水化合物的前體。已有 研究表明尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)是多糖生物合成的關鍵酶基因 (Journal of Bacteriology ,176(9):2611-2618；Biochemical Journal,370(1):995-1001)〇
[0003] 微生物絮凝劑(Microbial flocculant，MBF)是微生物分泌的能夠使懸浮液中的 固體顆粒、菌體、細胞和膠狀物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白 質、纖維素和DNA等。微生物絮凝劑具有安全、高效、可生物降解和對環境無污染等優勢，且 能產生絮凝劑的微生物種類多、生長快、易于采用工程手段而實現產業化。因此微生物絮凝 劑的開發前景十分看好。目前，多糖生物絮凝劑已經應用于去除紡織印染廢水中的色素 (Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4): 179-186·)，還可以去除工業廢 水中的重金屬離子和其它懸浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2) :361-367·)〇 然而多糖絮凝劑產量低、成本較高，制約著它的大規模工業化應用。目前，對于培養基、培養 條件、生長因子等外部因素影響多糖絮凝劑合成的報道已經很多(Process Biochemistry, 2014,49(4:576_582;Colloids and Surfaces 13:13;[0;[11七6『1^068,2014，116:257-264)。而 從地衣芽孢桿菌的遺傳及生理學角度對其多糖絮凝劑合成量影響的報道甚是少見。由于多 糖絮凝劑結構復雜，且大多數針對多糖的研究并不關注絮凝活性，所以有關多糖絮凝劑代 謝途徑的研究還較少，而通過分子生物學技術改造菌株提高多糖絮凝劑產量的報道幾乎沒 有。因此通過基因工程技術構建高產優良菌株，進一步提高多糖絮凝劑活性及產量，具有重 要的經濟價值及社會意義。
[0004] 本申請人在中國專利CN101503709中公開利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方 法，其中，微生物地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.2876。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于針對現有技術中多糖絮凝劑絮凝活性不高、調控機理不明等問 題，提供一株過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)的地衣芽孢桿菌基因工程菌 及其構建方法。
[0006] 所述過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)是編碼尿苷二磷酸葡萄糖 焦磷酸化酶的基因。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化生成的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是 葡萄糖的主要活化形式，也是合成多糖絮凝劑的必需前體，基于以上理論分析，過表達gtaB 基因，能夠增大多糖絮凝劑合成途徑的代謝流量，有利于提高多糖絮凝劑的產量，降低成 本。
[0007] 利用PCR擴增克隆多糖絮凝劑合成途徑的關鍵酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基 因 gtaB。
[0008] 所述過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No:l所示。
[0009] 所述過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)的地衣芽孢桿菌基因工程 菌的制備方法如下：
[0010]將過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)片段連接到表達載體上，然后 利用電轉化的方法導入到地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)中，通過抗性篩選獲得 目的基因的工程菌，即過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)的地衣芽孢桿菌基 因工程菌。
[0011 ] 所述地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.2876(參 見本申請人的在先專利CN101503709)。
[0012] 所述表達載體為游離載體，優選的所述表達載體為本實驗室構建的表達載體 PHY300PLK-PamyL-TTamyL。所述表達載體的啟動子為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)a-淀粉酶基因的啟動子PamyL。
[0013] 所述過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌基因工程菌的構 建方法，包括以下步驟：
[0014] (1)設計PCR引物擴增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因 gtaB;
[0015] (2)將擴增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL組成型啟動子PamyL 下游多克隆位點，得到PHY300-gtaB過表達質粒；
[0016] (3)然后將PHY300_gtaB過表達質粒導入到E.coli DH5a中，以備擴增后電轉化；
[0017] (4)將經提取、濃縮后的PHY300_gtaB過表達質粒電轉化地衣芽孢桿菌，37°C復蘇 5h后，涂布四環素抗性平板，再在37 °C培養12h，篩選轉化子；
[0018] (5)轉化子經質粒提取后，利用PCR和雙酶切進行驗證，從而獲得過表達尿苷二磷 酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌重組菌HN301-2。
[0019] 所述過表達尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌可在制備多糖絮 凝劑中應用，所述多糖絮凝劑的制備方法包括以下步驟：
[0020] (1)刮一環地衣芽孢桿菌重組菌HN301-2接種于液體種子培養基中培養，得種子培 養液；
[0021] (2)按體積百分比以4%的接種量接種于多糖絮凝劑發酵培養基中培養，得發酵 液；
[0022] (3)將發酵液離心收集上清液，再用乙醇提取，所得提取液冷凍真空干燥后即得多 糖絮凝劑。
[0023] 在步驟(1)中，所述培養的條件可為:35~37°C，200r/min培養12~16h。
[0024] 在步驟(2)中，所述培養的條件可為:在30~40°C，150~300r/min條件下培養50~ 60h，優選在37°C，200r/min的條件下培養48~56h。
[0025] 在步驟(3)中，所述乙醇與上清液的體積比可為3:1;所述提取的條件可為:離心的 速度為6000~8000rpm，離心的時間為10~15min，離心的溫度為4°C。
[0026] 本發明的技術效果在于:本發明提供了能提高多糖絮凝劑產量的的基因工程菌的 構建方法。該方法包括以下過程:克隆多糖絮凝劑合成途徑的關鍵酶尿苷二磷酸葡萄糖焦 磷酸化酶基因（gtaB)，利用大腸桿菌一芽孢桿菌穿梭質粒構建重組表達載體_。通過電轉化 的方法將重組質粒導入到地衣芽孢桿菌，通過四環素篩選轉化子，然后通過PCR和雙酶切對 對基因工程菌進行驗證(如圖1)，從而構建了地衣芽孢桿菌重組菌HN301-2,本發明構建的 地衣芽孢桿菌重組菌HN301-2比出發菌株的多糖絮凝劑產量提高了 15.6%，發酵液絮凝活 性提高了70% (如圖2)。可望用于多糖絮凝劑的工業化生產，提高產量，降低成本。
【附圖說明】
[0027]圖1為重組表達質粒PHY300_gtaB的PCR和雙酶切驗證結果圖，其中泳道1:重組質 粒PHY300-gtaB，泳道2:Kpn I單酶切重組質粒PHY300-gtaB，泳道3:Kpn I和Spe I雙酶切重 組質粒 PHY300-gtaB，泳道 4: PCR 擴增 gtaB。
[0028] 圖2為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)及其重組菌HN301-2多糖絮凝劑 絮凝活性和產量比較圖。
【具體實施方式】
[0029]根據下述實施例，可以更好理解本發明。然而本領域的技術人員容易理解，實施例 所描述的內容僅限于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發 明。
[0030] 實施例1:重組表達載體PHY300-gtaB的構建
[0031]設計PCR引物，用于擴增gtaB基因片段。
[0032]上下游引物分別為：
[0033] 上游引物:TTGGTACCATGAAAAAAGTAAGAAAAG(下劃線為Κρη頂每切位點）
[0034] 下游引物:GGACTAGTTTATATTTCTTCTTTATTTAAAAGA(下劃線為 Spe 頂每切位點）
[0035] 以Bacillus licheniformis CGMCC 2876基因組DNA為模板，進行如下PCR程序： (1)94°C，5min; (2)94°C，30s; (3)5