一種可提高胰島素負載效率的高分子微凝膠及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及高分子材料領域，特別是一種可提高胰島素負載效率的高分子微凝膠及其制備方法。
【背景技術】
[0002]胰島素，作為一種蛋白類藥物，廣泛用于糖尿病治療中。但是，在使用的過程中，胰島素經常會受到體內蛋白酶的作用影響而分解，失去活性。這種容易失活的缺陷大大限制了胰島素的使用效果，因此，如何在應用的過程中提高胰島素的穩定性，從而減少胰島素的應用限制，已經引起了科研工作者的廣泛關注。
[0003]目前，負載蛋白類藥物的方法主要有:I)物理包埋，利用高分子鏈的親疏水性構建聚合物膠束，并將蛋白類藥物包埋在膠束中；2)靜電吸附，利用高分子鏈與蛋白類藥物的電荷不同使其相互作用構建膠束，并將蛋白類藥物包埋于其中；3)化學鍵合，在蛋白類藥物表面共價鍵合可聚合單體后再與其它單體共聚，從而在蛋白周圍形成聚合物薄膜，這樣可有效避免蛋白變性或降解。蛋白質藥物納米載體已經在某些方面部分改善了蛋白質藥物的性能，表現出良好的應用前景，已有部分蛋白質藥物納米載體進入臨床試驗階段。但是，基于聚合物納米粒子的蛋白質藥物載體往往存在載藥困難、載藥量和載藥效率低的問題，因此當前對蛋白類藥物的負載研究距離工業化生產仍存在一段距離。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供一種可提高胰島素負載效率的高分子微凝膠及其制備方法和應用，該高分子微凝膠可提高微凝膠的胰島素負載效率，而且可實現胰島素的刺激響應釋放。
[0005]本發明的技術方案:
[0006]一種可提高胰島素負載效率的高分子微凝膠，由作為骨架的聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)和作為功能性單體的丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)與丙烯酰氨基二羧甲基-L-賴氨酸水合物(AANTA)構建而成，其中作為骨架的聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)為粒徑150-250nm且均勻分布的微凝膠粒子，微凝膠的結構式為P(NIPAM-co-AAPBA-co-AANTA)，該微凝膠粒子在室溫下為球形。
[0007]—種所述可提高酶熱穩定性的高分子微凝膠的制備方法，包括如下步驟:
[0008]I)合成丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)功能性單體
[0009]將氨基苯硼酸(APBA)溶于濃度為2N的氫氧化鈉溶液中，在冰浴中保持30min，然后緩慢滴入丙烯酰氯，氨基苯硼酸、氫氧化鈉溶與丙烯酰氯的用量比為8.22g:120mL:6mL，將溶液在冰水浴中保溫1.5h，然后把濃度為2N的鹽酸溶液加入到體系中得到固體物質，將固體物質分離后用水洗三次，得到AAPBA產物，將產物在真空中干燥得到最終的AAPBA產物；
[0010]2)合成丙烯酰二羧甲基-L-賴氨酸(AANTA)功能性單體[0011 ]①合成芐氧羰基-H-二羧甲基-L-賴氨酸(CBZ-NTA)[OO12]將芐氧羰基-H-賴氨酸(CBZ-1ys)和溴乙酸分別溶于濃度為2N的氫氧化鈉溶液中，芐氧羰基-H-賴氨酸與氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液的用量比為6g: 40mL，溴乙酸與氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液的用量比為5.96g: 21.5mL，分別得到CBZ-1ys溶液和溴乙酸溶液，然后在冰水浴條件下將CBZ-1ys溶液緩慢滴入溴乙酸溶液中，在70°C下反應4h，得到混合液，在室溫下將濃度為2N的鹽酸溶液緩慢滴入上述混合液中，芐氧羰基-H-賴氨酸、溴乙酸與鹽酸溶液的用量比為6g:5.96: 2 OmL，過濾得到CBZ-NTA的粗產物，將粗產物在真空條件下干燥得到白色固體芐氧羰基-H-二羧甲基-L-賴氨酸(CBZ-NTA);
[0013 ]②利用芐氧羰基-H-二羧甲基-L-賴氨酸(CBZ-NTA)合成二羧甲基-L-賴氨酸(NTA)
[0014]在冰浴條件下，將CBZ-NTA和鈀炭分別加入到50mL甲醇中，CBZ-NTA與甲醇的用量比為2g: 50mL，鈀炭與甲醇的用量比為0.2g: 50mL，將上述反應物加入燒瓶中，對燒瓶進行抽真空操作，在燒瓶內氣壓為1.0lkPa的條件下向燒瓶內通入一個大氣壓的氫氣，保持氣壓穩定條件下在25°C水浴中攪拌反應10小時，過濾得到濾渣，將濾渣用蒸餾水清洗10次后收集濾液并將其真空旋干得到產物二羧甲基-L-賴氨酸(NTA);
[0015]③利用二羧甲基-L-賴氨酸(NTA)來合成丙烯酰二羧甲基-L-賴氨酸(AANTA)
[0016]將NTA溶于濃度為2N的氫氧化鈉溶液中得到二羧甲基-L-賴氨酸溶液，NTA與氫氧化鈉溶液的用量比為lg:5mL，將丙烯酰氯溶于二氯甲烷中得到丙烯酰氯溶液，丙烯酰氯與二氯甲烷的用量比為9.6mL:1OmL，在冰水浴條件下在二羧甲基-L-賴氨酸溶液中緩慢滴入丙烯酰氯溶液得到混合溶液，混合溶液中NTA與丙烯酰氯的用量比為lg:9.6mL，攪拌反應4h，用濃度為2N的鹽酸溶液將混合溶液調至pH為5后旋干，然后分別用30mL的無水甲醇清洗三次，收集清洗液，最后將甲醇旋干得到AANTA產物；
[0017]3)微凝膠溶液的制備
[0018]將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)、丙烯酰二羧甲基-L-賴氨酸(AANTA)和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)溶于水中并混合均勻，過濾除去不溶雜質，然后通入氮氣0.5h來排空水溶液中的氧氣，將過濾后的溶液在70 °C下反應Ih后加入過硫酸銨(APS)進行反應8小時，得到微凝膠溶液，N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酰氨基苯硼酸(AAI3BA)、丙烯酰二羧甲基-L-賴氨酸(AANTA)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)水與過硫酸銨(八?5)的用量比為0.348:0.0638:0.1588:0.0088:10011^:0.0178;
[0019]4)將上述微凝膠溶液用超純水稀釋5倍得到稀釋的微凝膠溶液；
[0020]5)將上述稀釋的微凝膠溶液用超純水進行透析至少一周時間，透析完成后取出再加超純水至微凝膠溶液濃度為0.5mg/mL，制得高分子微凝膠溶液。
[0021 ] 一種所述可提高胰島素負載效率的高分子微凝膠的應用，用于提高提高胰島素的負載效率，方法如下:
[0022]I)將微凝膠加入緩沖溶液中制得微凝膠緩沖溶液，所述緩沖溶液為10mM、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液溶液；
[0023]2)將胰島素與異硫氰酸熒光素(FITC)在(TC條件下混合攪拌均勻，胰島素與異硫氰酸熒光素的摩爾比為1:1，然后振蕩12個小時，得到異硫氰酸熒光素標記的胰島素；
[0024]3)將制備的微凝膠緩沖溶液與異硫氰酸熒光素標記的胰島素混合均勻，微凝膠緩沖溶液與異硫氰酸熒光素標記的胰島素溶液的摩爾比為1:1，透析除去未反應的胰島素，在熒光激發波長為498nm處測定熒光值。
[0025]該微凝膠溶液提高胰島素負載效率的原理:
[0026]胰島素，作為一種具有生理功能的生物大分子，其三維結構決定了他們的活性和作用機理。其中胰島素B鏈上含有一個組氨酸殘基，成熟的胰島素儲存在胰島辟田胞內的分泌囊泡中，并通過組氨酸殘基上的咪唑基團與鋅離子配位，從而以六聚體方式存在。在外界刺激下胰島素隨分泌囊泡釋放至血液中，并發揮其生理作用。本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供一種可提高胰島素負載效率的高分子微凝膠，該微凝膠可提高胰島素負載效率，而且實現胰島素的刺激響應釋放。本項目擬利用含有AANTA的聚合物納米載體通過配位作用高效負載胰島素，并模擬胰島辟田胞針對葡萄糖濃度變化響應性釋放胰島素。
[0027]本發明的優點是:
[0028]該高分子微凝膠可提高胰島素負載效率，并實現葡萄糖刺激響應釋放胰島素。
【附圖說明】
[0029]圖1為得到的微凝膠的掃描電鏡照片。
[0030]圖2為微凝膠的葡萄糖響應開關實驗的曲線。
【具體實施方式】
[0031 ]以下通過實施例進一步詳細說明本發明。
[0032]實施例:
[0033]—種可提高胰島素負載效率的高分子微凝膠，由作為骨架的聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)和作為功能性單體的丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)與丙烯酰氨基二羧甲基-L-賴氨酸水合物(AANTA)構建而成，其中作為骨架的聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)為粒徑150-250nm且均勻分布的微凝膠粒子，微凝膠的結構式為P(NIPAM-co-AAPBA-co-AANTA)，該微凝膠粒子在室溫下為球形。
[0034]所述可提高酶熱穩定性的高分子微凝膠的制備方法，包括如下步驟:
[0035]I)合成丙烯酰氨基苯硼酸(AAPBA)功能性單體
[0036]將8.22g氨基苯硼酸(AI3BA)溶于120mL、濃度為2N的氫氧化鈉溶液中，在冰浴中保持30min，然后緩慢滴入6mL丙烯酰氯，將溶液在冰水浴中保溫體物質用水洗三次，得到AAPBA產物，將產物在真空中干燥得到最終的AAPBA產物；
[0037]2)合成丙烯酰二羧甲基-L-賴氨酸(AANTA)功能性單體
[0038]①合成芐氧羰基-H-二羧甲基-L-賴氨酸(CBZ-NTA)
[0039]將6g芐氧羰基-H-賴氨酸(CBZ-1ys)和5.96g溴乙酸分別溶于40mL和21.5mL濃度為2N的氫氧化鈉溶液中，分別得到CBZ-1ys溶液和溴乙酸溶液，然后在冰水浴條件下將CBZ-1ys溶液緩慢滴入溴乙酸溶液中，在700C下反應4h，得到混合液，在室溫下將20mL、濃度為2N的鹽酸溶液緩慢滴入上述混合液中，過濾得到CBZ-NTA的粗產物，將粗產物在真空條件下干燥得到白色固體芐氧羰基-H-二羧甲基-L-賴氨酸(CBZ-NTA);
[0040]②利用CBZ-NTA來合成二羧甲基-L-賴氨酸(NTA)
[0041 ] 在冰浴條件下，將2g CBZ-NTA和0.2g鈀炭分別加入到50mL甲醇中，在真空度為1.0lkPa的條件下通入一個大氣壓的氫氣，