一種兩性離子型聚合物微球及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物分離和生物醫學工程領域，具體設及一種兩性離子型聚合物微球 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 免疫檢測技術是一種基于抗原和抗體特異性作用的生化檢測方法，其發展來源于 19世紀50年代發明的免疫比濁檢測技術。免疫比濁檢測可W利用抗原抗體反應后形成的 沉淀或濁度來進行直接測定，但在臨床檢驗中，某些待測物在標本中的含量很低（甚至只 有納克級別）。因此為了尋找增加敏感度的方法，將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定 的物質加 W標記，通過測定標記物來提高敏感度。相繼出現的標記免疫分析技術如：酶免疫 檢測、化學發光免疫檢測和巧光免疫檢測等技術，其標記物分別為酶、化學發光物質和巧光 物質，運樣靈敏度可W提高數百至數千倍，檢測下限可W到達納克級別。由于抗體抗原之間 特異性的作用，免疫檢測常應用于復雜體系中某中物質的檢測，相比傳統的化學檢測方法， 更加快捷，準確。
[0003] 酶免疫檢測可分為均相和非均相兩種類型。均相酶免反應中游離的和結合的標記 物的分離比較困難，一般在不分離的情況下直接測定標記物，所W均相酶免疫檢的誤差可 能會比較大，在臨床檢驗中較少應用。非均相EIA則利用了固相載體，可W對游離的和結合 的標記物進行分離，運樣檢測的時候干擾就會比較小。但非均相酶免疫檢測由于其操作上 的復雜性阻礙了酶免疫檢測的發展和應用。
[0004] 近年來，隨著納米科技的高速發展，其在醫藥、能源、環境、生物技術等多個領域應 用越來越廣泛。納米材料的小尺寸效應和表面效應使得納米材料具有區別于宏觀材料所獨 特的性質。具中W聚合物納米微球為例，一方面由于表面具有豐富的可修飾基團，便于與抗 體，蛋白質，W及祀向配體的結合，另一方面作為固相載體，聚合物納米微球的某些獨特性 質對于免疫反應的信號放大、便于分離清洗W及在機器上實現全自動化起到了突出作用， 其在生物醫學領域的應用十分具有代表性。 陽〇化]例如膠乳增強免疫比濁法利用粒徑均勻的聚合物膠乳顆粒作為固相載體，使其吸 附特異性抗體，制成免疫性微球后，與傳統免疫比濁法相比，解決了當檢測少量的抗原抗體 時，其復合物極難形成濁度變化的問題。運是因為當結合了抗體的微球與抗原發生免疫反 應時，不溶性抗原抗體復合物快速在膠乳表面形成，由于聚合物膠乳復合物的粒徑要比單 純抗原抗體復合物的粒徑大得多，在可見光范圍內，比對反應前后的溶液濁度變化，既吸光 度的變化。膠乳增強免疫比濁法增強了免疫反應的反應信號，其吸光度的變化在一定范圍 內和被測物的含量成正比，由此可計算被測物含量。
[0006] 再如化學發光免疫檢測的原理是利用小分子叮晚醋等標記物的氧化還原反應，發 射的光子被光信號計量裝置接收后，進行數字處理，計算出標記物的相應發光值。而運一檢 測系統中的關鍵組分一-聚合物磁性微球承載了免疫反應固相載體的作用W及快速分離 的重要作用。首先抗體結合在聚合物磁性微球上，由于免疫反應的高特異性，將待檢測物從 待檢測樣本復雜的物質構成中分離捕獲出來，當加入帶有標記物的二抗時，在磁性微球上 形成兩株抗體夾待測物運一復合物形式，同時由于微球的超順磁性，在外加磁場下可快速 分離，W去除溶液中游離的帶有標記物的二抗，從而構建出待測物質和標記物的關系，也將 具體數字化的發光值與待測物含量聯系起來。
[0007] 最后巧光增強免疫層析是近年來出現的一種新型檢測方法，其方法是巧光（包括 稀±整合物、有機巧光染料等）聚合物微球上定向偶聯抗體片段，通過毛細作用，樣本中的 抗原與巧光微球表面抗體結合后，從而帶動繼續在膜上延展，在檢測線附近與固定的二抗 形成巧光微球-抗體-抗原-二抗復合物，直接檢測巧光微球的巧光，從而確定待測物中抗 原的含量。要求巧光微球可W免受一般溶劑的干擾，巧光發射強而穩定，巧光微球標記的抗 體在干燥溶解后仍然可W保持其巧光活性、生物活性和單分散的膠體狀態。巧光微球由于 可W實現很高的F/P值，對于實現高靈敏的巧光免疫分析提供了很好的應用前景。
[0008] W上=種方法均采用的聚合物微球通常是非常疏水的材料，直接應用會不可避免 存在蛋白質在材料表面吸附的問題，非特異性的蛋白吸附會造成試劑聚集，增加反映的本 底值，導致反應基線的波動，嚴重時甚至會造成假陽性或者假陰性的結果，直接影響到檢測 的可信度，形成誤診或者漏診等危害。因此，降低聚合物微球試劑非特異性吸附的研究越來 越受到重視。提高膠乳微球試劑的穩定性，W防止其聚集，降低其非特異性吸附并減少其在 血清或者全血中與樣品組分的非特異性互相作用，是如今體外診斷測定中的一個挑戰。
[0009] 疏水相互作用和靜電場被認為是非特異性吸附的兩大起因。疏水相互作用是通 過疏水物的非極性疏水基與水相互排斥作用而發生的。運種作用使疏水基相互靠猶，當蛋 白質分子與聚合物基質的作用時，會影響蛋白質的=維結構，使其變得結構松散，導致蛋白 質在基質表面發生構型的延展，甚至失活。靜電場的原理可W簡單描述為"同性相斥，異性 相吸"，因此靜電場對吸附的作用取決于蛋白質的等電點、體系的抑和聚合物表面的電荷情 況。另外聚合物表面也可W與雜質發生非特異性的覆蓋結合，運也是非特異性吸附的重要 起因。
[0010] 兩性離子聚合物是帶有等量正負電荷的聚合物，兩性離子聚合物通過離子溶劑化 作用，與水分子具有更強的結合能力。W細胞膜為例，其主要成分是憐脂類雙親性分子，在 水溶液中，細胞膜可W有效保持細胞表面形成一層緊密的結合水，并不與雜蛋白結合。憐酸 膽堿是組成細胞膜的基本單元的親水基端，是細胞外層膜中的最外層基團，具有電中性、高 親水性、無毒和在生理抑值下穩定的特性。常見的兩性離子聚合物單體有2-甲基丙締酷 氧基憐酸膽堿（MPC)、橫酸基甜菜堿和簇酸基甜菜堿等，使用運類物質修飾材料后，由于熱 力學作用使雙親性分子的疏水尾部與水的作用最小，親水基團最大限度地暴露出來與水接 觸，從而可W形成一層類似膜結構。同時，由于它們都是是電中性的，在一個給定的結構中 正電荷和負電荷平衡，導致材料表面由于靜電場的吸附也減少。將兩性離子通過共聚引入 疏水性的聚合物微球上W改善其親水性和降低其非特異性結合的方法在現在技術中還沒 有被報道過。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種兩性離子型聚合物微球及其 制備方法，將兩性離子通過共聚引入疏水性的聚合物微球上W改善其親水性和降低其非特 異性結合，同時在此基礎上引入長鏈官能團分子，通過化學鍵偶聯分子探針，一方面共價結 合使得的復合物更加穩定，同時長鏈的官能團可W減少偶聯時空間位阻，穩定結合的生物 分子活性。
[0012] 本發明的第一個方面是提供一種兩性離子型聚合物微球，包括載體和固載在載體 上的功能性配基，所述載體為疏水性聚合物微球，其中，所述載體上還固載有兩性離子基 團，所述兩性離子基團同時含有陽離子基團和陰離子基團。
[0013] 優選地，所述陽離于基團為胺基鹽離子、季錠或化晚陽離子等，所述陰離子基團為 簇酸基、橫酸基、憐酸基或硫酸醋基等。
[0014] 進一步優選地，所述兩性離子基團為憐酸基類兩性離子單體、橫酸基類兩性離子 單體和簇酸基類兩性離子單體中的一種或多種。
[0015] 更進一步優選地，所述兩性離子基團為2-甲基丙締酷氧乙基憐酸膽堿、橫酸基甜 菜堿（例如N，N-二甲基-N-甲基丙締酷胺基丙基-N-丙烷橫酸內鹽）和簇酸基甜菜堿（例 如N，N-二甲基-N-甲基丙締酷氧乙基-N-乙酸內鹽）。
[0016] 優選地，所述功能性配基為具有間隔臂的官能團單體。一方面引入的官能團結構 為共價結合提供活性位點，官能團種類和含量可根據實際需要進行調節，另一方面其長鏈 結構可避免兩性離子型憐酸膽堿單體對官能基團的遮蔽，減少偶聯時的空間位阻，為抗體 抗原的結合提供了有利條件。
[0017] 進一步優選地，所述功能性配基為帶有簇基的長鏈聚合物單體，例如帶有徑基的 聚合物單體（如甲基丙締酸徑乙醋，甲基丙締酸聚乙二醇單醋等）與帶有酸酢的分子（如 馬來酸酢，下二酸酢等）反應，徑基與酸酢形成醋鍵后，再裸露出另一分子的簇基，再通過 共聚引入到聚合物微球結構中。
[0018] 優選地，載體上功能性配基的有效載入量為100~1000 y mol/g