一種人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫學領域，提供了一種人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒及檢測方法。試劑盒中包括：septin9基因甲基化檢測位點對應的引物序列；septin9基因檢測位點探針序列；內參基因檢測位點對應引物序列；內參基因檢測位點探針序列，Septin9基因檢測位點為septin9基因CpG島3的一個位點；內參基因為Actin。本發明檢測試劑盒的設計及結果判讀在整個檢測流程中簡單方便，檢測結果可靠、特性性和靈敏性高。游離DNA酶解對septin9基因甲基化檢測，樣本損失量小。該方法簡便快速且經濟實用。本發明可輔助大腸癌的篩查和診斷，進而提高治愈率和降低死亡率。
【專利說明】
-種人體外周血游離DNA中se^ i n9基因甲基化檢測試劑盒及 檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物學和醫學領域，具體設及一種人體外周血游離DNA中septin9基因 甲基化檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 大腸癌是一種發生于下消化道系統的嚴重疾病，是世界=大惡性腫瘤之一。全世 界每年新發大腸癌病例136.1萬，直接導致69.4萬人死亡。隨著我國人民生活水平提高、飲 食習慣變化，大腸癌發病率正在提升，特別是北京、上海等大中城市大腸癌已逐漸成為除肺 癌外最常見的惡性腫瘤。大腸癌早期癥狀并不明顯，因民眾癌癥篩查意識薄弱和對現有檢 測技術的排斥，大多數患者感到不適去醫院就診時，已到了治愈率極低的癌癥中晚期，運導 致大腸癌的死亡率一直居高不下。大腸癌如果在早期被檢測出來，患者能獲得更高的治愈 率，支付更低的醫療費用。
[0003] 臨床上常用的大腸癌篩查方法大致有兩種，潛血試驗（fecal occult blood testing，F0BT)、結腸鏡檢查。潛血試驗是大腸癌的診斷方法當中最常見的。可利用簡便易 行的便潛血試驗監測該疾病。根據臨床觀察，發現大腸癌通常能夠導致患者表現為不同程 度的出血，目前多用于作為大規模人群普查的初篩手段。大便隱血測試其采樣方法復雜，敏 感性低，結果易受食物及藥物等的影響，假陽性率和假陰性率較高。有報道表明，FOBT靈敏 度只有15 % -30 %，具有較大的提供空間。
[0004] 結腸鏡是大腸癌篩查和確診的金標準，但其檢測繁瑣，檢測前需要相應做清腸準 備。并且，該檢查可能引起消化道出血、穿孔、感染等并發癥，致使大眾對該檢測有屯、理上排 斥。另外，在受檢者如患有屯、肺功能障礙、嚴重結腸炎、屯、臟病等不能進行結腸鏡檢查。因 此，兩種大腸癌檢查方法都存在不同程度的缺陷。在國外，45歲W上人群FOBT篩查率不足 15%，結腸鏡篩查率也不超過50%。在國內，FOBT和結腸鏡檢測預計均不到4%。由于上述方 法存在靈敏度或侵入性的問題，所W現在需要一種更為準確和方便的篩查方法來提高大腸 癌的篩查率。
[0005] 大腸癌的早期發現和早期診斷是早期治療獲得高治愈率的基礎，也是降低大腸癌 死亡率的關鍵。特別是在生物治療技術被廣泛推廣的今天，采取手術聯合生物治療進行早 期大腸癌的治療，五年生存率幾乎可達100%。因此，不斷的做好早期大腸癌的臨床篩查工 作至關重要。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的正是為了克服上述技術的不足，而提供一種人體外周血游離DNA中 septin9基因甲基化檢測試劑盒及檢測方法，設及游離DNA中S邱tin9基因甲基化檢測，輔助 在大腸癌篩查、臨床診斷和預后評估領域的應用，提供一種大腸癌中可用于穩定、高效率檢 測腫瘤的生物標記物septin9甲基化檢測的方法及其用途。
[0007]本發明的目的是通過如下技術方案來完成的。運種人體外周血游離DNA中septin9 基因甲基化檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中包括:septin9基因甲基化檢測位點對 應的引物序列；septin9基因檢測位點換針序列；內參基因檢測位點對應引物序列；內參基 因檢測位點探針序列，Septin9基因檢測位點為septin9基因 CpG島3的一個位點；內參基因 為Actin。
[000引所述septin9基因甲基化檢測位點對應的引物序列包括：
[0009] 正向引物：5 ' -GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3 '
[0010] 反向引物:5 ' -AAATGATCCCATCCAGCTG-3 '
[0011] 所述S邱tin9基因檢測位點探針序列:FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB。
[0012] 使用Actin作為內參基因，內參基因的的引物及探針序列如下：
[0013] 正向引物：5 ' -GCGCCGTTCCGAAAGTT-3 '
[0014] 反向引物：5 ' -CGGCGGATCGGCAAA-3 '
[0015] 檢測探針:VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB。
[0016] 所述septin9基因檢測探針和內參基因檢測探針5'端巧光探針為FAM、VIC、TET中 的一種。
[0017] 所述試劑盒中還包括陰性質控品、陽性質控品和空白對照。
[0018] 所述陽性質控品為全甲基化的人類基因組DNA;所述陰性質控品為非甲基化人類 基因組DNA。
[0019] 試劑盒檢測的樣本是外周血、尿液或唾液。
[0020] 運種采用人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒的檢測方法，該方 法包括如下步驟：
[0021] (a)外周血血漿分離；
[0022] (b)磁珠法提取游離DNA;
[0023] (C)游離DNA定量及酶解；
[0024] (d)實時巧光定量PCR檢測S邱tin9和Actin基因；
[0025] 檢測該標記物的技術為巧光定量PCR技術，采用化qman探針法檢測；
[0026] Septing基因檢測位點為S邱tin9基因 CpG島3的一個位點，其檢測引物及探針序列 如下：
[0027] 正向引物：5 ' -GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3 '
[002引反向引物:5 ' -AAATGATCCCATCCAGCTG-3 '
[0029] 所述S邱tin9基因甲基化位點檢測探針:FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB
[0030] 在巧光定量PCR檢測方法中，使用Actin作為內參照基因，其檢測引物及探針序列 如下：
[0031] 正向引物：5 ' -GCGCCGTTCCGAAAGTT-3 '
[0032] 反向引物：5 ' -CGGCGGATCGGCAAA-3 '
[0033] 檢測探針:VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB
[0034] 通過對游離DNA酶解方法，來檢測septin9基因甲基化可作為大腸癌篩查的生物標 記物。
[0035] 本發明的有益效果為：（1)游離DNA酶解再通過實時巧光定量PCR技術對S邱tin9基 因甲基化檢測，樣本損失量小。相對于用亞硫酸亞處理，該方法簡便快速且經濟實用。（2)本 發明可輔助大腸癌的篩查和診斷，進而提高治愈率和降低死亡率，是對目前大腸癌無創篩 查一個重要技術補充。（3)為大腸癌診斷、治療與預后提供新的試劑盒，方便臨床應用。
【具體實施方式】
[0036] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0037] 本發明提供一種大腸癌的生物標記物septin9甲基化檢測，其特征序列如下：
[0038] Septin9：aaaaacactcgagaataatgctgtggcttaggatggctgttgtgccggacccggcatcttc CC曰邑邑邑邑邑邑Ct邑t邑tt邑tt邑邑邑Ct邑曰邑tttctt曰邑邑t曰Ct邑邑曰CCCCC曰曰曰tcccc曰曰曰t曰C邑邑Cgtggacaggtgg CCC曰gt曰ggggctgg曰Ct曰tccg曰t曰ggccc曰ggtgctgg曰gttc曰g曰C曰曰g曰C曰teccctggcctggcgtgg曰曰g曰 t曰Cggggtgct曰tt曰曰tggc曰gc曰曰tggctgc曰tttctg曰曰曰cccgggctccc曰ggccg曰Cg曰gggtgtgc曰CgC曰t ctgaaatgtctgtggttttgcagttcccatgtccacaaactcacttggttgaaaatagttcaaaatatccaaagcat g曰ggg曰ggg曰gtgCCtgCttttctt曰曰曰曰曰gg曰曰gg曰Cttg曰tttC曰tct曰Ctt曰曰曰曰曰gCC曰CCC曰曰曰CCt曰g曰曰C attttccgcaagagaccccctgccccccgcctctccagaatggctggagagtctcagcactcctgcacatttgggat 曰tttC曰邑曰邑邑邑邑邑t邑邑邑邑曰邑邑邑邑C曰曰邑t邑邑邑C曰邑C邑曰邑C邑曰CCtC曰邑曰CCC曰邑邑曰t邑曰邑Ct邑tC曰邑邑C邑CtCCCC邑邑 CC曰C曰C曰ttc曰曰邑邑邑曰CC邑邑曰邑t邑C曰邑tt邑t曰邑C邑tt邑C邑邑CCt邑Ct邑CttC邑邑邑邑邑t邑邑邑邑邑t邑tt邑ttcc曰t邑Ct 邑t邑曰曰ttctc曰C曰t邑邑CCCCt邑曰Ctct邑邑邑C曰邑曰邑邑CC邑曰邑邑邑tct曰曰邑邑邑曰C邑邑邑邑t邑曰C曰邑邑邑曰邑曰邑C曰t邑C曰邑邑 a邑t邑邑邑tttct邑邑Ctttcca邑邑邑C邑a邑t邑邑aa邑aa邑C邑cctctctctctt邑ta邑邑t邑aca邑acct邑邑邑邑邑邑CCCttC ttgaggatgagagcctgttgcttctcaagttctgtgtctaacccaggtccccaggtctaccccagcccctcggccct 邑CCt邑CCtt邑t邑邑曰t邑曰t曰t曰邑ttt曰曰邑邑邑t曰邑曰邑曰CC邑Ct邑邑CCt邑邑曰邑邑邑曰曰邑邑Ct曰邑邑CCtcaggttagggCCC agaagggagggagaagcccttggggcagctccctttctgctcactcactgcctagctccttccttcacaccttcctt cggaaacgtctgctcctgacaaggtctacttcctgctctcaggaggcccttattgtggaggaagggaggcgtcgccc gtccctggcttctctgacagccgtgttccatccccgccctgtgccccttctcccggacagtgccttctccagggctc 曰CCC曰邑邑曰邑邑邑t邑C曰邑C邑邑t邑邑CCCCC邑邑邑邑C邑邑t邑邑tc邑t邑邑t邑邑邑邑邑t邑tt曰邑Ct邑CSggggtgCCCtCggtggg tgggagttggtggcctctcgctggtgccatgggactcgcatgttcgccctgcgcccctcggctcttgagcccacagg CC邑邑邑曰tcct邑CCt邑CC曰邑CC邑C邑t邑C邑Ct邑CC邑ttt曰曰CCCtt邑C曰邑邑C邑C曰邑曰邑C邑C邑C邑邑C邑邑C邑邑t邑曰C曰邑曰邑 aactttgtttggctgcccaaatacagcctcctgcagaaggaccctgcgcccggggaaggggaggaatctcttcccct ctgggcgcccgccctcctcgccatggcccggcctccacatccgcccacatctggccgcagcggggcgcccgggggga 邑邑邑邑Ct邑曰邑邑CC邑C邑tctctc邑CC邑tcccct邑邑邑C邑C邑邑邑CC曰邑邑C邑邑邑邑曰邑邑曰邑邑邑邑邑邑C邑CtCCggtCgtgtgCC caggactgtcccccagcggccactcgggccccagccccccaggcctggccttgacaggcgggcggagcagccagtgc 邑曰邑曰C曰邑邑邑曰邑邑CC邑邑t邑C邑邑邑t邑C邑邑邑曰曰CCt邑曰tcc邑CCC邑邑邑曰邑邑C邑邑邑邑邑C邑邑邑邑C邑邑邑邑邑C邑C曰邑C邑C邑C邑邑 ggaggggccggcgcccgccttcctcccccattcattcagctgagccagggggcctaggggctcctccggcggctagc tct邑cact邑Ca邑邑a邑C邑C邑邑邑C邑C邑邑C邑cccca邑cca邑C邑C邑Ca邑邑邑CCC邑邑邑CCCC邑CC邑邑邑邑邑C邑CttCCtC邑CC gctgccctccgcgcGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTcggaccccgcggtcaacgcgcagctggatgggatcat ttc邑邑曰CttC邑曰曰邑邑t邑邑邑t邑Ct邑邑邑Ct邑邑Ct邑Ct邑C邑邑CC邑C邑邑曰C邑t邑Ct邑邑曰邑曰邑邑曰CCCt邑CgggtgggCCtg 邑C邑C邑邑邑曰C邑邑邑邑邑t邑C邑Ct邑曰邑邑邑邑曰邑曰C邑邑邑曰邑t邑C邑Ct邑曰邑邑邑邑曰邑曰C邑邑邑曰CCCCt曰曰tcc曰邑邑C邑CCCtCCC 邑Ct邑a邑a邑C邑CC邑C邑C邑CCCCC邑邑CCCC邑t邑CCC邑C邑CC邑CCtac邑t邑邑邑邑邑accct邑tta邑邑邑邑caccc邑Cgtaga ccctgcgcgccctcacaggaccctgtgctcgttctgcgcactgccgcctgggtttccttccttttattgttgtttgt gtttgccaagcgacagcgacctcctcgagggctcgcgaggctgcctcggaactctccaggacgcacagtttcactct gggaaatccatcggtcccctccctttggctctccccggcggctctcgggccccgcttggacccggcaacgggatagg gaggtcgttcctcacctccgactgagtggacagccgcgtcctgctcgggtggacagccctcccctcccccacgccag tttcggggccgccaagttgtgcagcccgtgggccgggagcaccgaacggacacagcccaggtcgtggcagggtctag agtgggatgtcccatggcccccatccaggcctggggatatcctcatccgcctcccagaatcgggccgtgggggacag aaggggcctgcgtgcgggcagggagagtattttggctctctcctgtcttcggggtttacaaagtgtgttgggacttg Cggggctgctctgtccaagcctgggtctggcgtccgcgtctctgagcctgtgagtgcgtgcgctttcctgcgtcctc ttg過ctgccggtgctggggctctgcgtcctgcgtccgcggg過gt過過過t過C過gc過ggcg過過gggg過過gctc過C過C過過t ggtctccagcgctctggggcagggcttctgaggggcgggcctgcctctgccgggacctggagcccccgcccctcgga gaggctcctaggctgacttgggcagagccctctggtgggccgggagggggaaaggctgtgttgaaatgagcaaactg tcc過ggtgtc過ggcc過過gctggg過ggtg過CC過gcctg過ggtcctccccgctcc過tggcc過g過過CC過gggctg過C過tc tgggtgtcctgagcccagctgcccacacggcccacctggggtcagccctatctgagtgggggaggcggggcctcctg ggggaccagaactttggctggacgccaagcagagtgccagtggctgttcttcagggctgggcctgaggagggtgtgg ggcggcgaagggacgggagggggttgtgatccagtggccactggcgctgtgcagagtgtgagctggaaacatcgtag ttactttgtcagcttagtggtgaaagccctttttcaggctctatccctttgcatccctgcttcccagagggagggga ggtctgggtctgcagagctgggagggcttgctgttcccgcccccctcccccacaacacctcctcatctggacatctt tgggcacatgctcatactggggtctccctaggtccactgtgttccgttgagcctcctgcagtccccgagtgaatgtg acctccctgcccctgcctctttgcaactcctccctgcgaccgctcctccaggggccttccttgtcccaaatgtccaa gtggcacgacttagccggtctgaccactttccagtaagcccttatggagagaggccctgtgttgtgcagagctctcc tcctgcctgcgggatcgaggtctctgctctcagttcctaacagaaagtgtcgggcccccagtgggatttctggggaa gaactctcgtgtctcaacgggagccctgtggcgggaggggaggccagggtttggggttgtgttcgttgtacagctgt caccatttgcactatgaaagttgttagtgccccttcct
[0039] 本發明還同時提供了上述生物標記物的用途:制備用于篩查大腸癌或輔助大腸癌 病理鑒定、診斷和預后的試劑盒。
[0040] 作為本發明septin9基因甲基化檢測方法的改進:包括樣本前處理和檢測引物和 探針系統；
[0041 ] 檢測該標記物的技術為巧光定量PCR技術，采用化qman探針法檢測。
[0042] Septing基因檢測位點為S邱tin9基因 CpG島3的一個位點，其檢測引物及探針序列 如下：
[0043] 正向引物：5 ' -GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3 '
[0044] 反向引物:5 ' -AAATGATCCCATCCAGCTG-3 '
[0045] 所述S邱tin9基因甲基化位點檢測探針:FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB
[0046] 在巧光定量PCR檢測方法中，使用Actin作為內參照基因，其檢測引物及探針序列 如下：
[0047] 正向引物：5 ' -GCGCCGTTCCGAAAGTT-3 '
[004引反向引物:5 ' -CGGCGGATCGGCAAA-3 '
[0049] 檢測探針:VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB
[0050] 本發明的游離DNA中septin9基因甲基化檢測可用于大腸癌的篩查，輔助在大腸癌 篩查、臨床診斷和預后評估領域的應用。本發明主要是基于游離DNA中septin9基因甲基化 檢測主要通過W下步驟實現：
[0051 ] (a)外周血血漿分離；
[0052] (b)磁珠法提取游離DM;
[0053] (C)游離DNA定量及酶解；
[0化4] (d)實時巧光定量PCR檢測S邱tin9和Actin基因。
[0055] 本發明所述的大腸癌生物標記物為Septin9基因 CpG島3的一個甲基化位點；其應 用主要表現在:該甲基化基因在大腸癌患者血漿游離DNA中與正常人中顯示出差異性，可用 于對大腸癌患者進行篩查，用于輔助大腸癌病理鑒定、診斷和預后。
[0056] 本發明的技術方案是提供一種用于篩查大腸癌患者和輔助大腸癌病理鑒定、診斷 和預后的試劑盒，其由游離DNA提取、DNA酶解、引物系統組成和目標基因擴增系統組成。
[0057] 本發明通過實驗得出：通過對游離DNA酶解方法，來檢測septin9基因甲基化可作 為大腸癌篩查的生物標記物。
[0058] 本發明提供一種大腸癌的生物標記物septin9甲基化檢測試劑盒的應用具體方法 如下：
[0059] 實施例1.血漿分離及游離DNA提取
[0060] 1.血漿分離
[0061 ] 1)用邸TA抗凝管收集SmklOmL外周血；
[0062] 2)對血液樣本進行離屯、，1，600g，10分鐘；
[0063] 3)將收集的血漿樣本小屯、轉移至2mL離屯、管中；
[0064] 4)4°C條件下對血漿樣本進行離屯、，16，OOOg，10分鐘；
[0065] 5)將收集的血漿樣本小屯、轉移至新的2mL離屯、管中；
[0066] 6)收集完成的血漿樣本至于-2(TC保存。
[0067] 2.游離DNA的提取
[006引 1)在5mL無核酸酶管中加入2mL Lysis Buffer、IOOuL PK、15uL助沉劑、30uL磁珠 (使用前顛倒或使用移液器吹吸混勻磁珠）、600-1300化(最好IOO(KiL)樣品，震蕩混勻。室 溫，上下顛倒混勻20分鐘，使磁珠和核酸充分結合。
[0069] 2)將混合液轉至1.5mL離屯、管中，置于磁力架上1分鐘，吸棄液體。
[0070] 3)重復步驟2,直至所有混合液轉完，取下離屯、管。
[0071] 4)加入750UL Wash BufferI,使磁珠重新懸浮，簡短離屯、W去除管蓋內壁的液滴， 置于磁力架上1分鐘，吸棄液體，取下離屯、管。
[0072] 5)加入750uL Wash Buffern，使磁珠重新懸浮，簡短離屯、W去除管蓋內壁的液 滴，置于磁力架上1分鐘，吸棄液體。
[0073] 6)重復步驟5-次。
[0074] 7)加入45uL Elution Buffer,使磁珠重新懸浮，55°C水浴10分鐘，其間每隔2min 輕輕混勻磁珠一次。
[0075] 8)將離屯、管置于磁力架1分鐘，將液體轉移至新的1.5mL無核酸酶離屯、管，取化L測 濃度（如bit dsDNA 服 Kit)。
[0076] 實施例2.游離DNA酶解
[0077] 1)在0.5mL薄壁管中加入30ng游離DNA，IU的BstUI酶及緩沖液，總體積為50uL。
[007引 2)60°C水浴，10小時。
[0079] 3)經酶解后，含甲基化的DM會保留，未甲基化的DM被酶解。
[0080] 實施例3.巧光定量PCR檢測目的基因
[0081 ] 基于化qman探針的巧光定量PCR檢測：
[0082] 按照W下巧光定量PCR體系將試劑按W下順序依次加入到20化L EP管中：
[0083]
[0084]
[0085]
[0086] 實施例4.結果判讀
[0087] 巧光定量PCR定量檢測sept in9基因和act in基因。對于大腸癌患者血漿樣本，其 septin9基因存在CpG島3的一個甲基化位點；而actin不存在甲基化位點。對于正常人樣本， S巧tin9基因存在CpG島3的一個甲基化位點；而actin不存在甲基化位點。
[0088] 實驗設計：
[0089] 陽性對照為:全甲基化人類基因組;空白對照為:無核酶去離子水;待檢測樣本:經 酶解處理的游離DNA。
[0090] 結果判讀：陽性對照S邱tin9及內參actin均檢測到信號值小于40Ct值；
[0091 ] 空白對照septin9及內參actin具有背景值大于40Ct值；
[0092] 待檢測樣本:1)大腸癌樣本S邱tin9信號值小于40Ct值;actin信號值大于40Ct值；
[0093] 2)健康人樣本S邱tin9與actin信號值均大于40Ct值。
[0094] 顯然，本發明不限于W上實施例，還可W有許多變形。本領域的普通技術人員能從 本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑 盒中包括:sept in9基因甲基化檢測位點對應的引物序列；sept in9基因檢測位點探針序列； 內參基因檢測位點對應引物序列；內參基因檢測位點探針序列，Septin9基因檢測位點為 septin9基因 CpG島3的一個位點；內參基因為Actin。2. 根據權利要求1所述的人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒，其特 征在于:所述septin9基因甲基化檢測位點對應的引物序列包括： 正向引物:5 ' -GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3 ' 反向引物：5 ' -AAATGATCCCATCCAGCTG-3 ' 所述septin9基因檢測位點探針序列:FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB。3. 根據權利要求1所述的人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒，其特 征在于:使用Actin作為內參基因，內參基因的的引物及探針序列如下： 正向引物：5 ' -GCGCCGTTCCGAAAGTT-3 ' 反向引物:5 ' -CGGCGGATCGGCAAA-3， 檢測探針:VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB。4. 根據權利要求1所述的人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒，其特 征在于:所述septin9基因檢測探針和內參基因檢測探針5'端熒光探針為FAM、VIC、TET中的 一種。5. 根據權利要求1所述的人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒，其特 征在于:所述試劑盒中還包括陰性質控品、陽性質控品和空白對照。6. 根據權利要求1所述的人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒，其特 征在于:所述陽性質控品為全甲基化的人類基因組DNA;所述陰性質控品為非甲基化人類基 因組DNA。7. 根據權利要求1所述的人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒，其特 征在于:試劑盒檢測的樣本是外周血、尿液或唾液。8. -種采用如權利要求1所述的人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒 的檢測方法，其特征在于:該方法包括如下步驟： (a) 外周血血漿分離； (b) 磁珠法提取游離DNA; (c) 游離DNA定量及酶解； (d) 實時熒光定量PCR檢測Septin9和Actin基因； 檢測該標記物的技術為熒光定量PCR技術，采用Taqman探針法檢測； Septin9基因檢測位點為septin9基因 CpG島3的一個位點，其檢測引物及探針序列如 下： 正向引物:5 ' -GACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGT-3 ' 反向引物：5 ' -AAATGATCCCATCCAGCTG-3 ' 所述sept in9基因甲基化位點檢測探針:FAM-TTGACCGCGGGGTCCGAC-MGB 在熒光定量PCR檢測方法中，使用Actin作為內參照基因，其檢測引物及探針序列如下： 正向引物：5 ' -GCGCCGTTCCGAAAGTT-3 ' 反向引物:5 ' -CGGCGGATCGGCAAA-3， 檢測探針:VIC-ACCGCCGAGACCGCGTC-MGB 通過對游離DNA酶解方法，來檢測septin9基因甲基化可作為大腸癌篩查的生物標記 物。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861672SQ201610264899
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月26日
【發明人】朱聰, 張啟坤, 丁先鋒
【申請人】杭州壹鋒生物科技有限公司