一種檢測sept9基因甲基化的探針及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因檢測領域，更具體地，本發明涉及檢測SEPT9基因甲基化的探針 及其應用。
【背景技術】
[0002] DNA甲基化是基因表觀修飾方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能 關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。哺乳動物中，DNA的甲基 化僅發生于CpG的胞嘧啶上，在DNA甲基化轉移酶（DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'端 的胞嘧啶轉變為5'甲基胞嘧啶（mC)。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它可以 調控基因的表達。DNA甲基化是研宄最為深入的表觀遺傳學機制，其在維持正常細胞功能、 染色質結構修飾、X染色體失活、基因組印跡、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用。 [0003] 結直腸癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，全球每年新發病例數約為120 萬，年病死人數超過60萬。發病率僅次于肺癌和乳腺癌，位居惡性腫瘤第3位，病死率居第 4位。近年來，其發病率和死亡率呈逐年上升的趨勢。WHO統計數據表明，結直腸癌患者的 5年生存率在北美國家約為60%，而我國僅有32%。我國在結直腸癌診斷、治療水平上，與 發達國家相比還存在較大的差距。研宄認為，5年生存率與診斷時疾病的嚴重程度具有明顯 的相關性，進展期患者的5年生存率不到10%，而早期診斷的結直腸癌患者的5年生存率則 可達90%以上。因此，早發現、早診斷、早治療對于提高結直腸癌治療效果具有重大意義。
[0004]S印tin蛋白是一類具有鳥苷三磷酸激酶（GTPase)活性的蛋白家族，在人體內參 與了一系列的重要生理過程，如細胞內物質運輸、細胞分裂以及細胞凋亡等。人體內編碼 s印tin蛋白的基因共有13種。其中s印tin9基因（SEPT9)位于第17號染色體的17q25 位置，全長219kb，一共有18種不同的剪接產物，可以編碼15種多肽。這些變異剪接體的 分布具有組織特異性。最近的研宄結果顯示，SEPT9基因的甲基化（尤其是位于SEPT9基 因V2剪接體啟動子區CpG島的甲基化）與結直腸癌的發生和發展密切相關。它可以作為 結直腸癌早期診斷的一個特異性分子標記。因此，檢測SEPT9基因的甲基化狀態，對結直腸 癌的診斷、治療、預后判斷等方面具有重要意義。
[0005] 目前研宄DNA甲基化的方法主要有：1.甲基化敏感性內切酶法；2.重亞硫酸鹽 (Bisulfite)修飾法；3.特異性識別甲基化抗體分析法；4.質譜或色譜分析法等。其中重 亞硫酸鹽修飾法是目前應用最為廣泛的CpG甲基化檢測方法。該方法采用Na2S205處理樣 本DNA，將未發生甲基化的C轉化為U，而發生甲基化的mC保持不變；經過PCR擴增后，U轉 變為T，而mC轉變為C，從而使基因組上的甲基化/非甲基化轉變為C/T(Y)多態性，通過檢 測目標位點上的C/T狀態，可以確定是否存在基因的甲基化。
[0006] 基于重亞硫酸鹽修飾的甲基化檢測方法多種多樣，比如BSP克隆測序法、熒光PCR 法、芯片雜交法等。其中熒光PCR法和芯片雜交法都需要通過使用甲基化探針來識別目標 位點的甲基化狀態。通常情況下，甲基化探針基于完全甲基化的基因序列而設計，即檢測區 段內所有的CpG位點都采用G堿基與甲基化的C堿基互補配對，所以只能有效檢測完全甲 基化的樣品。腫瘤的發生、發展是一個極為復雜的過程，腫瘤細胞具有明顯的異質性特征。 不同的腫瘤細胞處在不同的發育階段，導致腫瘤細胞中SEPT9基因的甲基化程度隨發育進 程不斷變化。當腫瘤細胞中的SEPT9基因處于部分甲基化狀態時，常規探針與模板DNA的 結合效率較低，影響到檢測的靈敏度。極端情況下，檢測區段中存在1個非甲基化位點，就 可能導致探針與模板DNA無法結合，得到假陰性結果。按常規設計的甲基化探針不適合于 檢測SEPT9基因部分甲基化的樣本。
[0007] 因此，需要開發新的SEPT9基因甲基化探針及試劑盒，以便更加全面、有效地檢測 基因的甲基化狀態。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供檢測SEPT9基因甲基化的探針及其應用。
[0009] 在本發明的第一方面，提供一種用于檢測SEPT9基因甲基化的探針，所述的探針 的核苷酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDN0:4所示。
[0010] 在一個優選例中，所述的探針攜帶有可檢測標記物。
[0011] 在另一優選例中，所述的可檢測標記物為熒光標記物。
[0012] 在本發明的另一方面，提供一種用于檢測SEPT9基因甲基化的試劑盒，所述試劑 盒中包括所述的探針。
[0013] 在一個優選例中，所述試劑盒中還包括：PCR擴增SEPT9基因的引物；較佳地，所述 引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示。
[0014] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括：PCR擴增GAPDH基因的引物，以及特異性 檢測GAPDH基因的探針，該探針攜帶的可檢測標記物區別于針對SEPT9基因的探針所攜帶 的可檢測標記物。
[0015] 在另一優選例中，PCR擴增GAPDH基因的引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 14和SEQ IDNO: 15所示；特異性檢測GAPDH基因的探針核苷酸序列如SEQIDNO: 16所示。
[0016] 在另一優選例中，特異性檢測GAPDH基因的探針的5'端設置JOE熒光標記，3'端 設置BHQ1熒光標記；檢測SEPT9基因甲基化的探針的5'端設置FAM，3'端設置BHQ1熒光 記D
[0017] 在本發明的另一方面，提供一種非診斷性地檢測SEPT9基因甲基化的方法，所述 方法包括：以經過重亞硫酸鹽處理后的基因樣本，采用PCR法、基因芯片法或膜雜交法檢測 所述的探針與該基因樣本的結合情況，從而獲得待測基因樣本的SEPT9甲基化情況。
[0018] 在一個優選例中，所述的可檢測標記物是熒光標記物，利用SEQIDN0:6和SEQID NO: 7所示的PCR擴增引物以及權利要求1-3任一所述的探針進行熒光PCR法檢測，從而獲 得SEPT9基因的甲基化情況。
[0019] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0020] 圖1、常規探針檢測不同甲基化水平樣本的熒光擴增曲線。
[0021] 圖2、本發明探針檢測不同甲基化水平樣本的熒光擴增曲線。
[0022] 圖3、本發明試劑盒檢測SEPT9甲基化陽性樣本的擴增曲線。
[0023] 圖4、本發明試劑盒檢測SEPT9甲基化陰性樣本的擴增曲線
【具體實施方式】
[0024] 本發明人經過深入的研宄，揭示了一種優化的檢測SEPT9基因甲基化的探針，通 過在探針的特定位置引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基（I)，得到優化的SEPT9甲基化檢測探 針，其既能夠和完全甲基化的樣本DNA結合，又能夠容忍結合區段內存在1個非甲基化的位 點，從而有效提尚對不完全甲基化樣本的檢測效率。
[0025] 如本文所用，"樣本"或"樣品"需進行DNA甲基化狀態檢測的核酸物質，其可以來 自于個體（如人或動物），也可以是其它來源的，例如一些經擴增或未經擴增的實驗室核酸 材料，或人工合成的測試品。應理解，對"樣本"或"樣品"的檢測并非僅涉及診斷目的，還 可涉及其它非診斷目的。
[0026] 如本文所用，"互補"的序列通常是指將5' -3'方向的序列轉換為其3' -5'方向的 序列（如5'ATCG3' 一GCTA)，然后再取其互補序列（如GCTA- 5'CGAT3'）。
[0027] "互補"包括"基本上互補"，所述"基本上互補"是指兩段核苷酸的序列是足夠互補 的，可以以一種可預見的方式發生相互作用，如形成二級結構（如莖環結構）。通常，兩條 "基本上互補"的核苷酸序列互相之間至少有70%的堿基是互補的；優選的，至少有80%的 喊基是互補的；更優選的，至少有90%的喊基是互補的；進一步優選的，至少有95%的喊基 是互補的；如96%、98%。
[0028] 如本文所用，"完全互補"是指兩條"互補"的核苷酸序列之間有100%的堿基是互 補的。
[0029] 如本文所用，堿基的"配對"是指兩條序列中相應的堿基構成了鍵（如氫鍵）的連 接。兩條序列中足夠多（如多于70%、80%或90%的堿基是配對的）堿基的"配對"使得 兩條序列發生互補。
[0030] 本發明基于重亞硫酸鹽修飾的甲基化檢測方法，DNA樣本經過Na2S205處理后，未 發生甲基化的C轉化為U，而發生甲基化的mC保持不變，經過PCR擴增后，U轉變為T，而mC 轉變為C，從而使甲基化/非甲基化轉變為C/T(Y)多態性，通過檢測甲基化探針與重亞硫酸 鹽修飾產物的結合情況，可以明確樣本DNA的甲基化狀態。
[0031] 本發明的技術方案如下：根據SEPT9基因經過重亞硫酸鹽處理后的甲基化區域序 列，選擇一段包含5個CpG位點的區域（5'-TYGGATTTYGYGGTTAAYGYG-3'，其中YG代表CpG 位點）作為甲基化探針結合區；設計兩條與目標區段互補的甲基化探針：
【主權項】
1. 一種用于檢測SEPT9基因甲基化的探針，其特征在于，所述的探針的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4 所示。
2. 如權利要求1所述的探針，其特征在于，所述的探針攜帶有可檢測標記物。
3. 如權利要求2所述的探針，其特征在于，所述的可檢測標記物為熒光標記物。
4. 一種用于檢測SEPT9基因甲基化的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括權利要 求1-3任一所述的探針。
5. 如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括：PCR擴增SEPT9基 因的引物；較佳地，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示。
6. 如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括：PCR擴增GAPDH 基因的引物，以及特異性檢測GAPDH基因的探針，該探針攜帶的可檢測標記物區別于針對 SEPT9基因的探針所攜帶的可檢測標記物。
7. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，PCR擴增GAPDH基因的引物的核苷酸序列 如SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示；特異性檢測GAPDH基因的探針核苷酸序列如SEQ ID NO: 16 所示。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，特異性檢測GAPDH基因的探針的5'端設 置JOE熒光標記，3'端設置BHQl熒光標記； 檢測SEPT9基因甲基化的探針的5'端設置FAM，3'端設置BHQl熒光標記。
9. 一種非診斷性地檢測SEPT9基因甲基化的方法，其特征在于，所述方法包括：以經過 重亞硫酸鹽處理后的基因樣本，采用PCR法、基因芯片法或膜雜交法檢測權利要求1-3任一 所述的探針與該基因樣本的結合情況，從而獲得待測基因樣本的SEPT9甲基化情況。
10. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的可檢測標記物是熒光標記物，利用 SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:7所示的PCR擴增引物以及權利要求1-3任一所述的探針進行 熒光PCR法檢測，從而獲得SEPT9基因的甲基化情況。
【專利摘要】本發明涉及一種檢測SEPT9基因甲基化的探針及試劑盒。本發明揭示了一種優化的SEPT9甲基化檢測探針，通過在甲基化探針的特定位置引入2-3個脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基(I)，使其既能夠和完全甲基化的樣本DNA結合，又能夠容忍結合區段內存在1個非甲基化的位點，從而有效提高SEPT9基因甲基化的檢測效率。該探針結合SEPT9和GAPDH基因擴增引物，可應用于SEPT9基因甲基化檢測試劑盒。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104830855
【申請號】CN201510264501
【發明人】王東, 梁旺, 李賓
【申請人】基因科技（上海）有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月21日