烯烴生產的制作方法

烯烴生產的制作方法
【專利摘要】本發明涉及烯烴生產，提供了能夠從至少一種短鏈脂肪酸生產至少一種末端烯烴的微生物細胞，其中所述細胞經過遺傳修飾以包含- 至少第一個基因突變，其與野生型細胞相比增加選自CYP152過加氧酶家族的酶(E1)的表達，和- 至少第二個基因突變，其與野生型細胞相比增加至少一種NAD(P)+ 氧化還原酶(E2)和對應的調節蛋白的表達，其中所述短鏈脂肪酸是C4-C10脂肪酸。
【專利說明】
稀輕生產
技術領域
[0001] 本發明設及能夠從至少一種脂肪酸生產至少一種締控的細胞和/或生物技術方 法。具體地，所述締控是從短鏈脂肪酸生產的至少一種末端締控。
【背景技術】
[0002] 已經研究了多種方法來將生物質轉化成可W用作石油的可持續替代物的有價值 的化學化合物。石油(化學結構單元和運輸燃料的主要來源)正在被連續地消耗，并且價格 總是波動。因此，需要找到替代能源。一種運樣的能源是締控。
[0003] 例如，短鏈和中鏈a-締控不僅充當生物燃料，而且充當聚合物結構單元。具體地， 締控可W廣泛地用于制備潤滑劑、聚合物和去污劑。
[0004] 脂肪酸是用于生產締控的優選起始原料，因為它們含有處于低氧化態的碳。脂肪 酸還經常可W從天然資源(諸如脂肪）W低價格大量得到。
[0005] 在從脂肪酸生產締控中所用的現行方法在性質上是化學的，其中a-締控從飽和無 分支脂肪酸（含Cii)形成。運些方法經常需要昂貴的和/或有毒的基于金屬的催化劑和高溫 (>130°〇〇
[0006] 在2011年，Rude等人報道了采用P450單加氧酶Ole門尋無分支飽和長鏈Ci8-和Ci6- 脂肪酸(硬脂酸和棟桐酸)首先直接酶促脫簇成a-締控。該催化劑使用也化作為氧化劑經由 它的過氧化物旁路起作用，運會回避對天然氧化還原配偶體的需求。Belcher, J.，等人， 2014然后公開了OleT的晶體結構，并且將底物范圍擴大至Ci2-脂肪酸（月桂酸）。但是，也〇2 作為氧化劑的用途具有幾個安全性擔憂，不僅破壞它可能存在于其中的機理，而且是不穩 定的。向反應混合物中不斷地添加也化的需要也會增加反應的成本，并且是不方便的。因此， 可利用的生物技術方法是無效率的，并且不能W低成本生產高收率。因此，本領域中需要改 進的從可再生資源生產締控的生物技術方法。

【發明內容】

[0007] 根據本發明的任何方面的細胞通過提供從短鏈脂肪酸生產締控的生物技術方式 解決了上述問題。具體地，根據本發明的任何方面的細胞提供了通過至少具有C4-C10的鏈長 度的短鏈無分支飽和脂肪酸的氧化脫簇而生物催化合成末端締控的新酶級聯，其中所述細 胞不需要也化。所述新酶級聯包括脫簇反應，其是也化-非依賴性的，且可W被至少一種P450 單加氧酶催化。具體地，所述細胞表達酶，例如OleT,其可W能夠優化生物催化系統W使用 脫簇反應從短鏈脂肪酸生產至少一種締控。
[000引在本發明的一個方面，提供了能夠從至少一種短鏈脂肪酸生產至少一種末端締控 的微生物細胞，其中所述細胞經過基因修飾W包含 -至少第一個基因突變，其與野生型細胞相比增加選自CYP152過加氧酶 (peroxygenase)家族的酶化1)的表達，和 -至少第二個基因突變，其與野生型細胞相比增加至少一種NAD(P)+氧化還原酶化2) 和對應的調節蛋白的表達， 其中所述短鏈脂肪酸是C4-C10脂肪酸。
[0009] 與經常用于生產締控的常見化學催化路線不同，根據本發明的任何方面的方法可 W使用全細胞或分離的酶。運允許在溫和反應條件下進行所述方法，由此實現具有最小廢 物排放的可持續方法。運是一個意外的結果，因為現有技術（Fujishiro T.，2007和 Matsunaga I., 2002)報道稱，P450還原酶系統(諸如鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶)不 支持P45〇Bse和P450S化的活性。
[0010] 此外，根據本發明的任何方面的細胞允許從用作底物的短鏈脂肪酸大規模生產締 控。運可W在實例中看到，在所述實例中，使用IOmM的底物濃度來生產對應的締控。運是一 個意外的結果，因為目前可得到的締控生產方法表明了最大ImM的底物(諸如硬脂酸)轉化 成各種締控。
[0011] 根據本發明的另一個方面，提供了從至少一種短鏈脂肪酸生產至少一種末端締控 的方法。
[0012] 根據本發明的任何方面的方法具有其它優點，諸如它使用化作為氧化劑，其使得 該方法比本領域已知的使用此化作為氧化劑的方法更有效;該方法允許從可再生資源進行 電子轉移，并且根據本發明的任何方面的方法也導致顯著高的締控產量。
[0013] 根據本發明的另一個方面，提供了根據本發明的任何方面的細胞用于生產至少一 種末端締控的用途。
[0014] 根據本發明的任何方面的細胞可W直接地使用游離脂肪酸替代脂肪酸硫代酸醋 作為底物，其對于代謝工程而言可能是有利的，因為脂肪酸可W是更豐富的。此外，在已經 通常用作微生物細胞工廠的細胞(例如，大腸桿菌(E. COli))中可W更容易地操縱它們的 豐度和組成。
[0015] 因而，具有P450脂肪酸脫簇機制的根據本發明的任何方面的細胞可W保持經工程 改造成生物末端締控生產系統的巨大潛力。此外，根據本發明的任何方面的細胞會為脫簇 反應提供優化的生物催化系統(〉1〇〇 mg [I)，并將底物范圍延伸至短鏈脂肪酸。
[0016] 末端締控也可W被稱作末端締屬控，其表示在碳鏈的末端含有至少一個碳-碳雙 鍵的不飽和控。該C-C雙鍵可W是在控鏈的開始(a)處或末端（丫）處。最簡單的無環締控(僅 具有一個雙鍵且不具有其它官能團）可W具有通式Cn此n。在另一個實例中，末端締控也可W 包含其它官能團。根據本發明的任何方面的末端締控可W包含與底物短鏈脂肪酸相同數目 的碳原子作為碳原子的數目。例如，如果底物是下酸，形成的末端締控可W是丙締。類似地， 如果底物是戊酸(valeric acid/ pentanoic acid),形成的末端締控可W是下締；如果底 物是己酸(caproic acid/ hexanoic acid),形成的末端締控可W是戊締;如果底物是庚酸 (enanthic acid/ heptanoic acid),形成的末端締控可W是己締；如果底物是辛酸 (cap巧lie acid/ octanoic acid),形成的末端締控可W是庚締；如果底物是壬酸 (pelargonic acid/ nonanoic acid),形成的末端締控可W是辛締；如果底物是癸酸 (capric acid/ decanoic acid),形成的末端締控可W是壬締等。在一個實例中，使用在實 例中所示的新方法，可W測量從各種脂肪酸產生的締控諸如丙締和/或1-下締。
[0017] 在本發明中使用的術語"短鏈脂肪酸'表示具有小于10個碳的脂族尾己的脂肪酸 的亞組。所述脂肪酸可W是飽和的、不飽和的、支鏈或無支鏈脂肪酸。具體地，根據本發明的 任何方面使用的短鏈脂肪酸可W選自：丙酸、下酸(butyric acid/ butanoic acid)、戊酸 (valeric acid/ pent曰noic 曰cid)、己酉《（c曰proic acid/ hex曰noic 曰cid)、庚酉畫 (en 曰 nthic acid/ hept 曰 noic 曰 cid)、辛酉《（c曰pry I ic acid/ oct 曰 noic 曰 cid)、壬酉畫 (pel曰r邑onic 曰cid/ non曰noic 曰cid)、癸酉《（c曰pric acid/ dec曰noic 曰〇1(1)等。更具體地， 根據本發明的任何方面使用的短鏈脂肪酸可W是C2-C22脂肪酸。甚至更具體地，所述脂肪酸 可W是C4- ClO脂肪酸。在一個實例中，所述脂肪酸可W選自：乙酸、丙酸、異下酸（2-甲基丙 酸）、下酸、異戊酸(3-甲基下酸）、戊酸(戊酸)等。
[0018] 根據本發明的任何方面的細胞可W表示寬范圍的微生物細胞。具體地，所述細胞 可W是選自W下的原核或低等真核細胞：假單胞菌屬（Pseudomonas)、棒狀桿菌屬 (Corynebacter ium)、芽抱桿菌屬（Baci Ilus)和埃希氏菌屬（Escher ichia)。在一個實例中， 所述細胞可W是大腸桿菌(Escherichia coli)。在另一個實例中，所述細胞可W是低等真 核生物，諸如來自酵母屬（Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、 裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)和子囊菌酵母屬（化；rrowia)的真菌，特別是釀酒酵母 (Saccharomyces cereviSiae)。所述細胞可W是分離的細胞，換而言之，單個菌株的純培養 物，或可W包含至少兩個菌株的混合物。生物技術上有關的細胞是商購可得的，例如得自美 國典型培養物保藏中屯、(American Type Qilture Collection,ATCC)或德國微生物和細胞 培養物保藏中屯、（German Collection of Mic;roo;rganisms and Cell Qiltures，DSMZ)。用 于保存和改變細胞的顆粒可得自現有技術，例如Sambrook/化itsch/Maniatis (1989)。
[0019] 本文中結合細胞或微生物使用的短語"野生型"可W表示運樣的細胞:其具有呈在 野外天然地發現的形式的基因組構成。該術語可W應用于全細胞和單個基因兩者。術語"野 生型"因此不包括運樣的細胞或運樣的基因，其中人們已經使用重組方法至少部分地改變 了基因序列。
[0020] 根據本發明的任何方面使用的任何酶可W是分離的酶。具體地，根據本發明的任 何方面使用的酶可WW活性狀態并在有它的活性所必需的所有輔因子、底物、輔助性的和/ 或活化性的多膚或因子存在下使用。本文中使用的術語"分離的"是指，與它在其中天然地 存在的細胞相比，富集目標酶。所述酶可W通過SDS聚丙締酷胺電泳和/或活性測定來富集。 例如，目標酶可W占存在于制品中的所有多膚的超過5%、10%、20%、50%、75%、80%、85%、90%、 95%或99%，如在用考馬斯藍染料染色W后目檢聚丙締酷胺凝膠所判斷的。
[0021] 根據本發明的任何方面使用的細胞和/或酶可W是重組體。本文中使用的術語"重 組體"表示一種分子或由運樣的分子編碼，特別是多膚或核酸，其因而不會天然地存在，而 是基因工程的結果，或表示包含重組分子的細胞。例如，如果核酸分子包含運樣的啟動子， 則核酸分子是重組的：所述啟動子在功能上與編碼催化活性多膚的序列連接，且所述啟動 子已經經過工程改造，使得所述催化活性多膚與包含原始的未改變的核酸分子的對應野生 型細胞中的多膚水平相比過表達。
[0022] 根據本發明的任何方面使用的核酸分子、多膚(更具體地，酶)是否是重組體不一 定暗示它的表達水平。但是，在一個實例中，根據本發明的任何方面使用的一種或多種重組 核酸分子、多膚或酶可W過表達。本文中使用的術語"過表達"是指，編碼或表達的各種多膚 的表達水平或活性高于在沒有用于增加表達的基因修飾存在下在相同條件下在所述細胞 中（例如在各種野生型細胞中）通常存在的。本領域技術人員熟知眾多實現過表達的方式。 例如，要過表達的核酸分子或編碼要過表達的多膚或酶的核酸分子可W置于強誘導型啟動 子(諸如Iac啟動子）的控制下。現有技術描述了可W用于該目的的標準質粒，例如W祀T-3a 為代表的祀T載體系統（可商購得自Novagen)。通過定量PCR反應(在核酸分子的情況下）、 SDS聚丙締酷胺電泳、蛋白質印跡法或比較活性測定(在多膚的情況下），可W確定核酸或多 膚是否被過表達。基因修飾可W指向在選擇的和/或鑒別的培養條件下導致酶活性和/或選 擇性的變化的轉錄修飾、翻譯修飾和/或翻譯后修飾。因而，在本發明的不同實例中，為了更 有效地發揮功能，微生物可W包含一個或多個基因缺失。基因缺失可W通過突變性基因缺 失方案來完成，和/或開始于具有減少的運些酶中的一種或多種的表達或不表達的突變株， 和/或本領域技術人員已知的其它方法。
[0023] 根據本發明的任何方面使用的選自CYP152過加氧酶家族的酶化1)可W是細胞色 素 P450酶(CYP)的超家族的組成部分(Malca等人，2011)。通常，P450酶采用一個或多個氧 化還原配偶體蛋白將兩個電子從NAD(P)H轉移至血紅素鐵反應中屯、用于雙氧活化，然后將 化的一個原子插入它們的底物。在CYP152過加氧酶家族內的酶已經被鑒別為排它地使用 出化作為唯一電子和氧供體。但是，在根據本發明的任何方面的細胞中，NAD(P)+氧化還原 酶化2)和對應的調節蛋白可W用作電子和氧供體的來源。運是有利的，因為在低成本末端 締控的大規模生產中，大量過氧化物的應用是成本禁止性的，并且高此化濃度可W快速地滅 活生物催化劑。因此，NAD(P)+氧化還原酶化2)和對應的調節蛋白作為電子來源的應用會 提供末端締控的更有成本效益的微生物生產。運可W在Liu等人，2014中進一步解釋。
[0024] 具體地，酶Ei可 W選自：CYPspa(Eia)、CYPbsb 化lb)巧C 1.11.2.4)和OleT (Eic)。更 具體地，酶Ei可W是OleT化1。)或其變體。在一個實例中，酶Ei可W包含ADW41779.1的序列。 在一個實例中，酶Ei與SEQ ID NO: 1可W具有50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90〇/〇、 95〇/〇、98%、100% 序列同一性。
[0025] 技術人員能夠鑒別可W用于實現從至少一種脂肪酸形成至少一種末端締控的方 法的OleT的可能序列。在一個實例中，技術人員可W使用Liu等人，2014、Rude M.A，2011、 Schallm巧，A.，201UF址adaH.，1994、Belcher J.，2014等中的公開內容來確定OleT 化1。）的結構和將OleT化1。）引入合適細胞中并確定所述酶在所述細胞中的表達的方式。 OleT (與其它出化依賴性的酶反應相比）可W導致更高收率的人工電子轉移系統。
[0026] 根據本發明的任何方面的細胞可W包含第二個基因突變，其與野生型細胞相比增 加至少一種酶、NAD(P)+氧化還原酶化2)和對應的調節蛋白的表達。運些酶屬于氧化調節 蛋白并接受兩個電子的氧化還原酶家族。具體地，NAD(P)+氧化還原酶使用鐵-硫蛋白作為 電子供體并使用NAD+或NADP+作為電子受體。化nnemann等人公開了可W用作根據本發明的 任何方面的酶E2的氧化還原-介質的不同類別的列表。在一個實例中，人工/"化學"氧化還 原介質可W將電子從還原酶或電子來源轉移至血紅素鐵簇。
[0027] 更具體地，NAD(P)+氧化還原酶化C 1.18.1.5)和對應的蛋白可W選自： (a) 鐵氧還蛋白還原酶巧2a)和鐵氧還蛋白；或者 (b) 假單抱氧還蛋白還原酶巧2b)和假單抱氧還蛋白（Schallm巧，A.，2011)。
[002引具體地，E2可W是CamA,且調節蛋白可W是CamBDEs可W與沈Q ID: N0:2具有500/0、 550/0、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、100%序列同一性，和/或調節蛋白可^與569 ID: NO: 3具有500/0、550/0、600/0、650/0、700/0、750/0、800/0、850/0、900/0、950/0、980/0、1000/0序列同一性。
[0029] 在一個實例中，在根據本發明的任何方面的細胞中，E2可W是鐵氧還蛋白還原酶 化23)，其中鐵氧還蛋白也可W存在，且E2a可W能夠在功能上與El相互作用。具體地，El和E2 的來源可W相同或不同。在一個實例中，Ei和E2可W來自相同來源，例如來自泊庫島食燒菌 (Alcanivorax borkumensis) SK2 (登錄號YP_691921)。在該實例中，6扣和鐵氧還蛋白可W 分別具有登錄號YP_691923和YP_691920。
[0030] 在另一個實例中，在根據本發明的任何方面的細胞中，E2可W是假單抱氧還蛋白 還原酶巧2b)，其中假單抱氧還蛋白也可W存在，且E2b可W能夠在功能上與Ei相互作用。在一 個實例中瓜b可W來自得自惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的P450cam酶系統。對于假 單抱氧還蛋白還原酶，采用的酶的量通常可W是約100-10,000 ca、1000-5000 ca、2000- 4000 Ca或特別是3000 ca。該Ca是假單抱氧還蛋白還原酶在介導鐵氯化物對NADH的氧化中 的活性的單位，并且定義為每mg還原酶每分鐘氧化的1皿〇1的NADH。
[0031] E2是已經純化或分離的重組蛋白或天然存在的蛋白。E2可W已經經過突變W改善 它的性能，諸如W優化它進行電子轉移的速度或它的底物特異性。采用的還原酶的量取決 于測量對象的確切性質和測定的特定細節，但是通常，所述還原酶將^〇-1〇〇〇41、〇.〇〇1- 100咖、0.01-50咖、0.1-25咖和特別是1-10咖的濃度存在。
[0032] 根據本發明的任何方面的細胞進一步包含至少第=個基因突變，其與野生型細胞 相比增加至少一種能夠再生輔因子的酶啦）的表達。具體地，扮可W能夠再生NADWH"E3可 W是可W能夠再生NAD(P)H的任何酶。具體地，E3可W是使用NAD(P)作為電子受體的脫氨 酶/氧化還原酶化C 1.1.1 .X)。更具體地，&可W是在2014年2月24日在化enda數據庫中具 有KEGG號EC 1.1.1 .X的任何酶。例如，E3可W選自：醇脫氨酶、甘油憐酸脫氨酶、組氨醇脫氨 酶、莽草酸脫氨酶、乳酸脫氨酶、3-徑基芳基-CoA脫氨酶、蘋果酸脫氨酶、異巧樣酸脫氨酶、 6-憐酸葡萄糖脫氨酶、甲酸脫氨酶、馬肝醇脫氨酶、葡萄糖脫氨酶、氨基酸脫氨酶、山梨醇脫 氨酶、20-0-徑基類固醇脫氨酶和甲醒脫氨酶。甚至更具體地，酶巧3)可W選自：葡萄糖脫氨 酶化3a)化C 1.1.99.10)、亞憐酸脫氨酶化3b)化C 1.20.1.1)和甲酸脫氨酶化3C)化C 1.2.1.43)，其中葡萄糖、亞憐酸鹽和甲酸鹽分別用作還原劑。酶化3)的存在允許輔因子再 生，運使得從脂肪酸生產締控的方法是自持續的。因此不必將外部能量引入生產締控的系 統中。因此，根據本發明的任何方面的細胞可W能夠在有至少酶61、&和/或E3存在下無需任 何外部能源從脂肪酸產生至少一種締控。
[0033] 在一個實例中，葡萄糖脫氨酶(E3a)可W是NADP+-特異性的葡萄糖脫氨酶。充當葡 萄糖脫氨酶(E3a)的來源的生物不受限制，且可W是微生物或高等生物，并且微生物諸如細 菌、真菌和酵母是合適的。例如，芽抱桿菌屬（Bacillus)的微生物、特別是巨大芽抱桿菌 (Bacillus megaterium)可W是來源。在另一個實例中，所述來源可W是屬于隱球菌屬 (Cryptococcus)、葡糖桿菌屬化Iuconobacter)或酵母屬（Saccharomyces)的微生物。具體 地，可W選擇屬于隱球菌屬的微生物，更具體地，所述微生物可W選自：白色隱球菌 (Cryptococcus albidus)、±生隱球菌（C;ryp toco ecus humi CO Ius)、地生隱球菌 (Cryptococus terreus)和指甲隱球菌（Cryptococcus uniguttul曰tus)。
[0034] 在另一個實例中，酶E3可W是亞憐酸脫氨酶化3b)或甲酸脫氨酶化3C)。充當亞憐酸 脫氨酶化3b)或甲酸脫氨酶化3。)的來源的生物可W不受限制，且可W是微生物或高等生物， 并且微生物諸如細菌、真菌和酵母是合適的。
[00對在一個實例中，根據本發明的任何方面的細胞與酶Elc、E2a和E3a的野生型細胞相比 具有增加的表達。在另一個實例中，根據本發明的任何方面的細胞與W下酶的野生型細胞 相比具有增加的表達:Elc、E2a和Esb ; Elc、E2a和E3c ; Elc、E2b和E3a ; Elc、E2b和Esb ;或Elc、E2b和E3c。
[0036] 本發明的教導不僅可W使用具有在本申請中明確地(例如通過名稱或登錄號）或 暗示地提及的確切氨基酸或核酸序列的生物大分子實現，而且可W使用運樣的序列的變體 實現。本文中使用的術語"變體"包含與參照氨基酸或核酸序列分別具有至少70%、75%、80%、 85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98或99%同一性的氨基酸或核酸序列，其中優選地除了功 能(例如蛋白的催化活性)或分子的折疊或結構必需的那些氨基酸W外的氨基酸被缺失、置 換或被插入替換，或必需氨基酸W保守的方式被替換W達到參照序列或從其衍生出的分子 的生物活性被保留的效果。現有技術包括可W用于比對兩個給出的核酸或氨基酸序列和計 算同一性程度的算法，參見Arthur Lesk (2008), I'hompson等人，1994,和Katoh等人， 2005。術語"變體"與術語"同系物"同義地和可互換地使用。運樣的變體可W如下制備:在氨 基酸或核酸序列W及包含運樣的大分子或其變體的融合體中引入缺失、插入或置換。在一 個實例中，關于氨基酸序列，術語"變體"除了包含W上序列同一性W外，還包含與各個參照 或野生型序列相比包含一個或多個保守氨基酸變化的氨基酸序列，或包含編碼含有一個或 多個保守氨基酸變化的氨基酸序列的核酸序列。在一個實例中，氨基酸序列或核酸序列的 術語"變體"除了包含W上序列同一性程度W外，還包含所述氨基酸序列或核酸序列各自的 任意活性部分和/或片段，或編碼氨基酸序列的活性部分和/或片段的任意核酸序列。本文 中使用的術語"活性部分"表示運樣的氨基酸序列或核酸序列:其分別小于全長氨基酸序列 或編碼小于全長氨基酸序列，其中所述氨基酸序列或所述編碼的氨基酸序列分別保留它的 基本生物活性的至少一些。例如蛋白酶的活性部分和/或片段可W能夠水解多膚中的膚鍵。 本文中使用的短語"保留它的基本生物活性的至少一些"是指，目標氨基酸序列具有超過和 不同于背景活性的生物活性和表征所述活性的動力學參數，更具體地ktat和Km優選地是在 參照分子相對于特定底物表現出的值的3、2或1個數量級內。類似地，術語核酸的"變體"包 含運樣的核酸，其互補鏈優選地在嚴謹條件下與參照或野生型核酸雜交。技術人員能夠容 易地確定酶61、&和/或E3,所述酶將能夠根據本發明的任何方面從脂肪酸制備締控。
[0037] 在有此化存在下和沒有出化存在下（即在有酶E2存在下和替代調節蛋白）在根據本 發明的任何方面的細胞中發生的反應的差異的圖解顯示在化學反應路線1中。具體地，在化 學反應路線1 (A)中，顯示了將飽和脂肪酸脫簇為末端締控的酶促氧化還原-級聯。顯示了 電子從氨化物供體(例如葡萄糖、甲酸鹽或亞憐酸鹽)經由CamAB轉移至OleT,所述OleTW大 氣化為代價催化脂肪酸氧化脫簇為具有在C3-C21范圍內的鏈長度的末端締控。檢測到的副 產物顯示在括號中。在化學反應路線1 (B)中，顯示了在有出化存在下的相同反應。
化學反應路線1:01eT對無分支飽和脂肪酸的氧化脫簇。
[0038] 雜交反應的嚴謹性由本領域普通技術人員容易地確定，且通常是依賴于探針長 度、洗涂溫度和鹽濃度的經驗計算。一般而言，較長的探針需要較高的溫度才能適當對合， 而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當存在于低于它們的烙化溫度的環境中時 變性的DNA與互補鏈重新對合的能力。探針和可雜交的序列之間的期望同源性程度越高，可 W使用的相對溫度越高。所W，接下來較高的相對溫度將傾向于使反應條件更嚴謹，而較低 的溫度使反應條件不太嚴謹。關于雜交反應的額外細節和嚴謹性的解釋，參見F. M . Ausubel (1995)。本領域技術人員可W遵循在手冊"The DIG System Users Guide for Filter Hybridization''，Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993和在 Liebl等人，1991(關于如何借助于雜交來鑒別DNA序列）中給出的指導。在一個實例中，將 嚴謹條件應用于任何雜交，即僅當探針與祀序列具有70%或更多同一性時發生雜交。與祀序 列具有較低同一性程度的探針可W雜交，但是運樣的雜交體是不穩定的，且將在嚴謹條件 下在洗涂步驟中除去，例如通過將鹽濃度降低至2 X SSC，或者，任選地和隨后，降低至0,5 X SSC，而溫度W遞增優先順序為大約50°C- 68°C、大約52°C- 68°C、大約54°C- 68°C、大約 56°C- 68°C、大約58°C- 68°C、大約60°C- 68°C、大約62°C- 68°C、大約64°C- 68°C、大約66 °C- 68°C。在一個特別優選的實施方案中，溫度是大約64°C- 68°C或大約66°C- 68°C。可能 將鹽濃度調至0.2 X SSC或甚至0.1 X SSC。可W分離與參照或野生型序列具有至少70%、 80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性程度的多核巧酸片段。本文中 使用的術語核酸序列的"同系物"表示，按照遺傳密碼的簡并性，編碼與參照核酸序列相同 的氨基酸序列的任何核酸序列。
[0039] 技術人員將能夠容易地測量酶Ei、E2和E3中的每一種的活性。例如，為了確定細胞 中的Ei的表達是否增加，技術人員可W使用在Liu等人，2014，Rude M.A，2011、 Schallmey, A.，2011等中公開的測定。例如，為了確定細胞中的E2的表達是否增加，技術 人員可W使用在Sch邱S, D, 2011、Roome等人，Schallm巧等人等中公開的測定。使用至少 在化del等人中公開的測定，可W測量細胞中的E3的表達，無論它是增加還是下降，在所述 測定中將甲酸脫氨酶活性測定(經由NAD(P)+還原)確定為在340 nm的吸光度的變化。技術 人員將容易地能夠鑒別本領域中的其它眾所周知的方法，所述方法可W用于測量在本發明 的細胞中使用的酶的表達。
[0040] 根據本發明的任何方面的細胞與野生型細胞相比可W具有降低的通過0-氧化降 解脂肪酸的能力。具體地，與野生型細胞相比降低的脂肪酸降解活性可W是與野生型細胞 相比選自W下的至少一種酶的減少表達的結果：酷基輔酶A脫氨酶（FadE)化6)化C: 1.3.99.-)、締酷輔酶A水合酶(FadB)化7)化C 4.2.1.17)、（10-3-?基酷基輔酶A脫氨酶 (化地）化8)巧C 1.1.1.35)和3-酬脂酷基輔酶A硫解酶(FadA)巧9)巧C:2.3.1.16)。
[0041] 本文中使用的術語"具有降低的脂肪酸降解能力"是指，各個細胞降解脂肪酸(特 別是從環境吸收的那些）的速度低于具有正常脂肪酸降解能力的可比較細胞或野生型細胞 在相同條件下的速度。在一個實例中，因為至少一個編碼在e-氧化途徑中設及的酶的基因 的缺失、抑制或滅活，運樣的細胞的脂肪酸降解較低。在一個實例中，與各種野生型微生物 中的相同酶在可比較條件下的活性相比，至少一種在e-氧化途徑中設及的酶W遞增優先順 序已經喪失5%、10%、20%、40%、50%、75%、90%或99%活性。本領域技術人員可能熟知可W用于 缺失編碼酶的基因或降低細胞中運樣的酶的活性的各種技術，例如通過將細胞暴露于放射 性、隨后積累或篩選得到的突變體，點突變的定位引入，或編碼活性酶的染色體整合基因的 敲除，如在Sambrook/化itsch/Maniatis (1989)中所述。另外，可W過表達轉錄抑制子化dR 達到在e-氧化途徑中設及的酶的表達被抑制的效果(Fujita，Y.，等人，2007)。本文中使 用的短語"基因的缺失"是指，編碼所述基因的核酸序列經過修飾，使得由所述基因編碼的 活性多膚的表達減少。例如，可W如下缺失基因：在框架內除去包含編碼多膚的催化活性中 屯、的序列的序列的一部分。可選地，可W改變核糖體結合位點，使得核糖體不再翻譯對應的 RNA。使用如在酶學教科書(例如Cornish-Bowden, 1995)中所述的標準測定測量由活細胞 表達的酶的活性，屬于本領域技術人員的常規技能。
[0042] 脂肪酸的降解通過一系列酶促催化反應來實現。首先，脂肪酸通過運輸/酷基-活 化機制而被吸收和跨細胞膜轉移，所述機制包括至少一種外膜蛋白和一種內膜結合的具有 脂肪酸輔酶A連接酶活性的蛋白，在大腸桿菌的情況下分別被稱作化化和化dD/Fa服。在細 胞內，要降解的脂肪酸遭受催化0-氧化途徑的其它反應的酶。第一個細胞內步驟設及酷基 輔酶A通過酷基輔酶A脫氨酶轉化成締酷輔酶A，后者在大腸桿菌的情況下被稱作化祀。可W 如在現有技術中所述測定酷基輔酶A脫氨酶的活性，例如通過分光光度計法在340 nm在100 mM M0PS(pH 7.4X0.2 mM締酷輔酶A、0.4 ml NA護中監測NA畑的濃度。得到的締酷輔酶A通 過締酷輔酶A水合酶/(10-3-?基酷基輔酶A脫氨酶(在大腸桿菌中被稱作化地和化dj)催化 的水合和氧化經由3-徑基酷基輔酶A轉化成3-酬酷基輔酶A。可W如在現有技術中所述(例 如如關于化祀所述)通過分光光度計法測定締酷輔酶A水合酶/3-徑基酷基輔酶A脫氨酶活 性，更具體地產物NADH的形成。最后，大腸桿菌中的3-酬脂酷基輔酶A硫解酶化dA和化dl催 化3-酬酷基輔酶A的裂解，W產生乙酷輔酶A和縮短了2個碳原子的輸入酷基輔酶A。可W如 在現有技術中（例如在Antonenkov, V.，等人，1997中）所述測定酬脂酷基輔酶A硫解酶的 活性。
[0043] 本文中使用的短語"具有降低的脂肪酸降解能力的細胞"表示具有降低的吸收和/ 或降解脂肪酸(特別是具有至少8碳鏈的那些）的能力的細胞。可W W不同的方式降低細胞 的脂肪酸降解能力。具體地，根據本發明的任何方面的細胞與其野生型相比具有降低的在 e-氧化途徑中設及的酶的活性。本文中使用的術語"在e-氧化途徑中設及的酶"表示運樣的 酶:其與通過e-氧化途徑作為脂肪酸降解的一部分而形成的脂肪酸或其衍生物直接地相互 作用。e-氧化途徑包含一系列實現脂肪酸轉化為乙酷輔酶A和縮短的脂肪酸的輔酶A醋的反 應。在e-氧化途徑中設及的酶通過將脂肪酸或其衍生物識別為底物，可W將它轉化為作為 e-氧化途徑的一部分而形成的代謝物。例如，酷基輔酶A脫氨酶化C 1.3.99.-)是在0-氧化 途徑中設及的酶，因為它與脂肪酸輔酶A相互作用并將脂肪酸輔酶A醋轉化成締酷輔酶A，后 者是作為e-氧化的一部分而形成的代謝物。在另一個實例中，本文中使用的術語"在e-氧化 途徑中設及的酶"包含選自W下的任意多膚:酷基輔酶A脫氨酶化C 1.3.99.-)、締酷輔酶A 水合酶化C 4.2.1.17)、3-徑基酷基輔酶A脫氨酶EC 1.1.1.35)和3-酬-酷基輔酶A硫解酶 化C 2.3.1.16)。酷基輔酶A合成酶化C 6.2.1.1)可W催化脂肪酸轉化為脂肪酸的輔酶A醋， 即運樣的分子，其中簇基的官能團-OH被-S-CoA替換，并將所述脂肪酸引入0-氧化途徑。例 如，大腸桿菌中的多膚化郵和化化（登錄號分別是：BAA15609.巧日NP_416216.4)是酷基輔 酶A脫氨酶。在一個實例中，本文中使用的術語"酷基輔酶A脫氨酶"可W是能夠催化酷基輔 酶A轉化成締酷輔酶A(作為0-氧化途徑的一部分）的多膚。例如，大腸桿菌中的多膚化dE (登錄號：BAA77891.2)可W是酷基輔酶A脫氨酶。本文中使用的術語"締酷輔酶A水合酶"也 被稱作3-徑基酷基輔酶A脫氨酶，表示能夠催化締酷輔酶A轉化成3-酬酷基輔酶A(通過水合 和氧化，作為e-氧化途徑的一部分）的多膚。例如，大腸桿菌中的多膚化地和化dj (登錄號 分別是：BAE77457.1和P77399.1)是締酷輔酶A水合酶。本文中使用的術語"酬脂酷基輔酶A 硫解酶"可W表示運樣的多膚:其能夠催化3-酬酷基輔酶A的裂解，從而產生縮短了 2個碳原 子的酷基輔酶A和乙酷輔酶A，作為0-氧化途徑的最終步驟。例如，大腸桿菌中的多膚化dA和 化dl (登錄號分別是：YP_491599.1和P76503.1)是酬脂酷基輔酶A硫解酶。
[0044] 本文中使用的術語"接觸"是指在水溶液中實現根據本發明的任何方面的氨基酸、 脂肪酸和/或細胞之間的直接接觸。例如，細胞、氨基酸和脂肪酸可W不在被屏障(諸如無機 膜）隔開的不同隔室中。如果氨基酸或脂肪酸是可溶性的且可W被細胞吸收或可W跨生物 膜擴散，可W將它簡單地加給水溶液中的根據本發明的任何方面的細胞。在它的可溶性不 足的情況下，可W將它在加入水溶液中之前溶解在合適的有機溶劑中。本領域技術人員通 過加入合適的有機溶劑和/或極性溶劑能夠制備具有不足可溶性的氨基酸或脂肪酸的水溶 液。運樣的溶劑可W W包含液體有機溶劑的有機相的形式提供。在一個實例中，當在25°C和 標準大氣壓為液體時，有機溶劑或相可W視作液體。在另一個實例中，脂肪酸可W W脂肪酸 醋(諸如各種甲醋或乙醋）的形式提供。在另一個實例中，可W在體外使化合物和催化劑接 觸，即W大致上富集的或甚至純化的狀態，或可W在原位接觸，即它們作為細胞代謝的一部 分而產生，并隨后在細胞內反應。
[0045] 術語"水溶液"或"培養基"包含任何含水的溶液(主要是水)作為溶劑，所述溶劑可 W用于至少暫時地將根據本發明的任何方面的細胞維持在有代謝活性的和/或可存活的狀 態，且包含(如果運是必要的話)任何額外的底物。本領域技術人員熟知眾多水溶液的制備， 所述水溶液經常被稱作可W用于維持本發明細胞的培養基，例如就大腸桿菌而言的LB培養 基。有利的是使用基本培養基作為水溶液，所述基本培養基即適當簡化組成的培養基，其與 復合培養基相比僅包含將細胞維持在有代謝活性的和/或可存活的狀態所必不可少的鹽和 營養物的最小集合，W避免不希望的副產物對產物的不必要污染。例如，M9培養基可W用作 基本培養基。
[0046] 根據本發明的任何方面，將脂肪酸加入包含根據本發明的任何方面的細胞的水溶 液中。該步驟可W不僅包括使脂肪酸與所述溶液暫時接觸，而且事實上在有所述細胞存在 下溫育脂肪酸足W允許氧化反應和可能的其它下游反應發生的時間，例如至少1、2、4、5、10 或20小時。選擇的溫度必須使得本發明的細胞保持催化活性和/或代謝活性，例如10-42°C， 優選30-40°C，具體地，在所述細胞是大腸桿菌細胞的情況下，32-38°C。
[0047] 在一個實例中，根據本發明的任何方面的方法可W包括在步驟(a)之后或與步驟 (a)同時地將"水不可混溶的有機溶劑"加入根據本發明的任何方面的細胞和脂肪酸的混合 物中的另一個步驟。本領域技術人員知曉根據本發明的任何方面可W使用的眾多水不可混 溶的有機溶劑。在一個實例中，本文中使用的術語"水不可混溶的有機溶劑"表示運樣的化 合物:其包含至少2個碳原子且具有在有水性液相存在下在25°C形成與所述水相明顯分離 的另一個液相的趨勢。分離的相可W是連續液相或乳狀液。在一個實例中，本文中使用的術 語"水不可混溶的"表示液體化合物不可溶于水的趨勢。在另一個實例中，本文中使用的術 語"水不可混溶的"是指，如此命名的化合物具有特定抑-值(J Sangster, 1997)，所述抑- 值的十進對數超過〇、〇.5、1或2。水不可混溶的有機溶劑的例子包括、但不限于選自W下的 水不可混溶的溶劑:在室溫為液體的取代的和直鏈的燒控，環燒控，環締控，芳基化合物，月旨 肪酸，脂肪酸醋，醇，雜環燒控，雜環締控和雜芳基化合物。水不可混溶的有機溶劑可W包含 超過一種有機溶劑。在一個優選的實施方案中，本文中使用的術語使用"水不可混溶的有機 溶劑""萃取"產物是指，使包含根據本發明的任何方面的細胞的水溶液與水不可混溶的有 機溶劑接觸足夠長W允許所述產物進入包含水不可混溶的溶劑的相中。隨后，可W使包含 水不可混溶的有機溶劑的相與水溶液分離，例如通過蒸饋或通過傾析。
[0048] 在一個實例中，水不可混溶的有機溶劑可W是脂肪酸或其醋，在一個實例中，所述 脂肪酸由式C出-(C此)x-C00Rs表示，其中X是8、9、10、28，且更優選地是12或超過12，且其 中Rs是H或烷基，所述烷基可W是甲基或乙基。在一個實例中，水不可混溶的有機溶劑可W 是不飽和脂肪酸，其在碳鏈的位置9處具有碳-碳雙鍵的脂肪酸，或具有12個或更多碳原子。 在另一個實例中，水不可混溶的有機溶劑可W是油酸或己酸或月桂酸甲醋。水不可混溶的 有機溶劑的體積使得它與水溶液直接分離。在一個實例中，水不可混溶的有機溶劑的體積 是水溶液和水不可混溶的有機溶劑的組合總體積的2-98%、5-95%、10-40%或20-30%。
[0049] 具體地，根據本發明的任何方面的方法的輔因子可W是NAD+/NADH。更具體地，所 述方法進一步包括用于再生消耗的輔因子NAD(P)+的偶聯輔因子再生方法。所述偶聯輔因 子再生方法也包括消耗的犧牲的葡萄糖、甲酸鹽、麟等的再生。
【附圖說明】
[0050] W下附圖和非限制性實例進一步解釋了本發明，從W下附圖和非限制性實例可W 明白本發明的其它實施方案、方面和優點。
[0051 ] 圖1是得自OleT-CamAB抑H對庚酸的轉化的色譜圖（級聯.a = C02; b = EtOH; C =1-己締 ；d = MIBK (衍生自化OH)。將化合物從反應容器頂空手工地注射進GC-MS色譜儀 中。
[0052]圖2是手工頂空GC-MS注射1-己締的分析標準品W后的色譜圖。
[0053] 圖3是與I-己締(84.1 g/mol)對應的圖I中的峰C的GC-MS波譜的圖。
[0054] 圖4是與1-己締的分析標準品（84.1 g/mol)對應的圖2中的峰C的GC-MS波譜的圖。
[0055] 圖5是來自OleT-CamAB-抑H級聯對庚酸的轉化的離子84的離子提取W后得到的色 譜圖。
[0056] 圖6是使用提取的離子84的峰面積關于1-己締的手工頂空GC-MS注射的校正曲線。
[0057] 圖7是用于捕集揮發性的a-締控(諸如1-丙締和1-下締）的新反應方案的圖。將含 有10 ml 20 ml Br2/DCM溶液的小塵埃測定器放在燒瓶的頂部充當唯一氣體出口和捕集a- 締控產物。使用1-庚締的分析標準品成功地證實了該系統的功能性。在路線圖2中顯示了揮 發性a-締控的衍生化和捕集的概念。
[0化引圖8是通過OleTCamAB-抑H級聯從戊酸生產1-下締的GC-FID色譜圖。1 =塵埃測定 器溶液(DCM/Br2);2 =用OleT-CamAB-抑H級聯轉化戊酸24 hW后塵埃測定器溶液的內容 物。3 = 1,2-二漠下燒的分析標準品；4 =在沒有OleT下戊酸轉化24 hW后塵埃測定器溶液 的內容物。a =溶劑峰(DCM) ;b = 1,2-二漠下燒；C =來自DCM溶劑的雜質。
[0059] 圖9是通過OleT-CamAB-抑H級聯從戊酸生產1-丙締的GC-FID色譜圖。1 = 1,2-二 漠丙烷的分析標準品；2 =用OleT-CamAB-FDH級聯轉化戊酸24 hW后塵埃測定器溶液的內 容物。3 =用OleT-CamAB-抑H級聯轉化下酸24 hW后塵埃測定器溶液的內容物;4 =塵埃測 定器溶液(0〔1/^2)巧=溶劑峰(0〔1);6 = 1，2-二漠丙烷；〇 = 1，2-二漠下燒；（1 =來 自DCM溶劑的雜質。 實施例
[0060] 前面描述了優選的實施方案，其如本領域技術人員將理解的，可W進行設計、構造 或運行方面的變化或修改，而不脫離權利要求的范圍。例如，運些變化意圖被權利要求的范 圍涵蓋。
[0061] 實施例1 OleT的克隆、表達和定量 所有化學物質得自Sigma Al化ich。渡菜鐵氧還蛋白、渡菜鐵氧還蛋白還原酶、得自牛 肝的過氧化氨酶、溶菌酶、得自牛屯、臟的細胞色素 C和葡萄糖脫氨酶(NADPH依賴性的，澄清 商業來源)得自Sigma Al化iCh。甲酸脫氨酶(NADH依賴性的）得自Evocata 1。根據標準方案 制備亞憐酸脫氨酶(PDH) (Dudek, H.M., 2〇13)，質粒得自M. Rraaije (Groningen)。
[0062] 從Life Technologies訂購OleT,作為為了在大腸桿菌中的最佳表達經過密碼子 優化的合成基因。將合成的構建體通過限制/連接(NdeI和趾Ol)克隆進祀T28a表達載體在 N-端His廣標簽下游（pET28a-01eT)，然后化學轉化進大腸桿菌SHuff Ie ? T7菌株（New England Biolabs)。通過菌落PCR、限制性分析和測序，驗證成功的克隆。將含有pET28a- OleT的細胞在補充了5化g ml/i卡那霉素的溶源性肉湯化B)培養基中培養過夜（140巧m， 37°C)作為預培養物。根據公開的方案(Nazor, J，2009)，通過將2mL預培養物轉移進200 mL極好肉湯(terrific b;roth)(TB)培養基中，實現OleT的表達。在25°C和140巧m搖動下溫 育20 h后，實現OleT的有效表達。將細胞通過離屯、與表達培養基分離，并將沉淀物在-20°C 儲存24 h。將冷凍的細胞沉淀物再懸浮于純化緩沖液化Pi; 0.1 M; pH 7.0; 20%甘油， 0.3 M KC1; 50 mM咪挫）中。加入溶菌酶(1 mg ml/i)，隨后在37°C溫育1 h。最后使用超聲破 碎器通過聲處理（I min, 30%振幅)破碎細胞。通過離屯、使細胞碎片沉淀，并將無細胞的裂 解物壓過〇.45ym過濾器W除去殘余的顆粒。將過濾的無細胞的裂解物加載到與具有紫外檢 測器的Biorad FPLC累送系統連接的化S-化ap柱上。根據Matsunaga等人，2001的方案純化 OleT,但是使用400 ml (而不是200 ml)咪挫用于最終的洗脫步驟。在用報道的透析緩沖液 化Pi, 0.1 M，抑7.0, 20%甘油)透析純化的OleT的過程中，大量蛋白形成沉淀(僅1-化1 OleT的活性蛋白濃度得到保留）。為了除去殘余的咪挫和預防沉淀，在含有300 ml KCl的憐 酸鹽緩沖液化Pi, 0.1 M，pH 7.0, 20%甘油）中進行透析。將蛋白裂解物裝入透析管纖維 素膜（14 kDa截止值，Sigma Aldrich, Steinheim,德國）透析袋中，并在300 ml透析緩沖 液中在4°C和連續攬拌下透析3次（3 X 12 h)。在透析操作過程中沒有發生肉眼可見的沉 淀，并且通常得到〉1化M的活性P450濃度。通過記錄CO差異波譜，確定無細胞的裂解物或純 化的OleT中的活性P450蛋白的濃度。
[0063] CamAB系統的克隆、表達和定量 根據公開的采用報道的質粒構建體和大腸桿菌宿主的方案(Schallmey, A., 2011)， 進行CamA和CamB (CamAB)的表達。
[0064] 產物提取、脂肪酸和徑酸的衍生化 通過加入10化L 5 N肥1，澤滅酶反應（1血規模）。用50化L含有0.1%1-癸醇的化OAc作 為內部標準品，執行底物和產物的萃取。將有機相經無水化2S化干燥。通過將有機相與MeOH (2.5:1.5 v/v)混合，隨后補充5-15化2 M TMSCHN2 (S甲基甲娃烷基重氮甲燒在乙酸中 的溶液），實現簇酸（脂肪酸和徑酸）向對應的甲醋的衍生化。將混合物在25°C和750 rpm溫 育30 min，然后注射進GC-FID或GC-MS中。使用相同方案，執行來自短鏈FA (C12-C9)的轉化 的產物和底物的萃取和衍生化，但是所有步驟都在冰上進行W防止不希望的揮發性產物的 損失。
[0065] 用于頂空GC-MS分析的樣品的制備 將得自具有C22至ClO范圍的鏈長度的FA底物的產物在HP5柱(Programm)上分離，并通 過GC-FID或GC-MS進行檢測。將萃取的來自壬酸的轉化的產物（1-辛締作為產物)在DB1702 柱(Programm)上分離，并通過GC-FID進行檢測。如上所述處理底物和末端締控的真正標準 品，并用作參比物用于鑒別和制備校正曲線。通過從小瓶頂空手工注射進GC-MS中，完成揮 發性的短鏈末端締控(1-下締/1-丙締[進行中]至1-庚締）的檢測，為了防止產物的損失，將 含有反應混合物的小瓶用PTFE隔膜密封。轉化W后，將封閉的小瓶與10 ml注射器(TYPE) - 起在80°C加熱10 min。從頂空將2-地1體積無分流地注射進GC-MS色譜儀中，并在冊5柱 (Programm)上分離分析物。W相同的方式在4°C并使用5%DMF作為共溶劑，制備1-戊締、1-己 締和1-庚締的校正曲線。
[0066] 實施例2 用CamAB-OleT氧化還原級聯和作為氧化劑的化轉化FA 一個經優化的純化方案允許改善活性形式的OleT的生產(來自400 mL培養液的10-2化 M)，從而避免在透析巧SI)過程中的蛋白沉淀。使用細菌CamAB (假單抱氧還蛋白；I類)作為 電子轉移系統化Oga H.，1989和Roome P.W.，1983)(化學反應路線1)。初步實驗證實， OleT可W接受來自CamAB的電子，從而允許用化作為唯一氧化劑將硬脂酸脫簇，而對照反應 不會導致任何產物形成(表1)。此外，發現較低的CamAB濃度對于較高的轉化而言是最適的。 在I ml NADH的完全氧化W后根據生產商的方案使用高靈敏的HRP/ABTS測定（Sigma Al化ich)可W檢測到沒有形成此化（經由化的還原而形成），進一步指示從CamAB至OleT的 直接電子轉移，并排除出化對OleT的潛在滅活。
[0067] 表1:使用化/CamAB或此〇2作為氧化劑用于硬脂酸和棟桐酸的脫簇時OleT的催化 表征.
化應朱巧：iyM UieT, U.Ub U mi 1 UamAB, iZUU U mi 1巧韓化母，i 物， 2.5%Et0H，KPi緩沖液(pH 7.5, 0.1 M)。在塑料比色皿中在室溫和沒有攬拌下進行轉化。 與作為氧化劑的也化的反應僅含有OleT、底物、緩沖液和過氧化氨。 切見察到強沉淀。 1下述組分之一被排除在反應物之外:01eT、也〇2、CamAB、NAD(P)H或底物。
[0068] 實施例3 用CamAB-Ol eT氧化還原級聯和NAD (P化再生系統轉化FA 基于葡萄糖脫氨酶(GDH)的系統的應用會提供轉化率(對于ImM硬脂酸為36%轉化率)和 TTN (對于10 mM硬脂酸多達389)的大幅增加，硬脂酸和棟桐酸具有可比較的轉化率。24 h 反應時間W后，得到1.16 mM (0.27 g L-1) 1-十屯碳締和1 mM (0.21 g L-1) 1-十五碳 締的產物濃度，但是不可進一步增加。因此研究了作為GDH和葡萄糖實現的NAD(P化再生的 副產物而形成的葡糖酸的抑制作用，并已經發現10 mM的濃度會顯著降低OleT生產力（28% 下降）。基于亞憐酸脫氨酶（PDH; NADPH依賴性的）（Dudek，H.M.，2013和化tis J.M.， 2002)和基于甲酸脫氨酶(抑H; NADH依賴性的）（Busto E.，2014)的替代系統被證實是更 有效的：從5 mM硬脂酸分別得到2.6 mM (0.62 g 1^-1)和3.1 mM (0.75 g L-I) 1-十屯碳 締(分別是5?)和62%轉化率），從而使用上述再生系統產生到目前為止最高的TTN值(分別是 1739和2096)。與W前公開的全細胞反應系統相比，該FDH驅動的系統允許在8 h反應時間W 后對于42.5 mg L-I h-1的a-締控而言高6倍的產物滴度和高21倍的體積生產力(相對于在 48 h中的98 mg L-I)(表2)。
[0069] 表2:使用化作為氧化劑采用不同氧化還原配偶體系統時OleT對硬脂酸的脫簇.
反應條件：0.05 U ml-i CamAB, 1200 U ml-i過氧化氨酶，12 U ml-i GDH或2 U ml-i GDH或0.2 U ml-i P畑，100 mM D-葡萄糖或100 mM甲酸錠或100 mM亞憐酸鋼，5 mM硬脂 酸，2.5%EtOH，KPi緩沖液(pH 7.5, 0.1 M)和20化1 NAD(P)Hd在封閉的玻璃小瓶中在1 ml規模在室溫和170巧m搖動下進行反應24 h。 平化/Fdx天然地存在于大腸桿菌中，并允許電子從NAD(P)H轉移至OleT。 b反應物含有53 mg表達OleT的細胞的冷凍干燥的裂解物。
[0070] 實施例4 采用抑H-CamAB-OleT氧化還原-級聯對脂肪酸(FA)的脫簇. 通過將FA鏈長度從C3變為C22,進一步研究了OleT的底物范圍。除了在室溫的標準方案 W外，還在4°C研究了該反應W防止高揮發性的短鏈a-締控的損失，運會導致令人驚訝地高 的活性水平(表3)。首次可W將短FA脫簇為對應的締控，覆蓋從Cll低至C4的整個范圍。令人 感興趣的是，從反應試管釋放的強烈"汽油味"會識別短鏈FA (<C10)的轉化。由于短鏈締控 的高揮發度，在4°C進行產物后處理。收率強烈地依賴于反應溫度和底物鏈長度，在C18W下 在室溫反應性顯著下降（來自5 ml硬脂酸的最大產物濃度2.45 mM)，而C12似乎是在4°C的 最佳底物(來自5 ml月桂酸的2.53 ml產物）。通過GC-MS對來自短鏈FA (C8-C5)的反應物的 頂空分析證實了各種Q-締控的形成，從而允許第一次通過生物技術用OleT獲得1-庚締、1- 己締和1-戊締和1-下締。
[0071] 表3:采用抑H-CamAB-OleT氧化還原-級聯將FA脫簇.
反應條件:使用3 iiM 01eT、6 iiM OleT(對于底物C12-C3)執行底物C22-C14的轉化。所 有反應混合物含有0.05 U nd-l CamAB、1200 U ml-1過氧化氨酶、2 U ml-1抑H、100 ml甲 酸錠、5%Et0H、10 ml底物、KPi緩沖液(pH7.5, 0.1 M)和200 iiM NADH。在有作為共溶劑的5% DMSO存在下進行底物C8、C7和C6的轉化。使用手工頂空GC-MS注射，實現短鏈末端締控的檢 測和定量。在封閉的玻璃小瓶(RT樣品/24 h)或攬拌(4°C樣品/72 h)下在1 ml規模和170 巧m搖動下進行所有轉化。 *相對于C18的轉化率/僅GC-面積. n. i.=未研究。
[0072] 實施例5 OleT從庚酸生產的I-己締的鑒別和定量 使用OleTCamAB-FDH反應級聯如在實施例4中所述進行庚酸的轉化。如在圖1中所示可 靠地進行庚酸的脫簇。
[0073] 使用1-己締的分析標準品證實祀產物的形成。分析標準品在相同保留時間洗脫 (2.617 min;圖1和2,峰C)并表現出與OleT形成的反應產物相同的m/z模式（圖3和4)。
[0074] 相應地在0.05-2 mM范圍內制備1-己締的校正曲線。由于1-己締與C〇2和化OH的峰 面積的強重疊（圖1，峰a、b和C)，使用GC-MS的離子提取模式產生可靠的校正曲線。對于1-己 締，使用如在圖5中所示的特征性離子84用于定量。0)2和化OH都沒有干擾產物峰面積。運可 W通過對比圖1和5看到，其允許使用手工頂空GC-MS注射進行1-己締的可靠和線性定量（圖 6)。
[0075] 對于具有Cll至C6的鏈長度的所有底物，成功地執行向GC-MS中的手工頂空注射。 得到的產物濃度總結在表3中。10 mM庚酸的轉化允許不經反應條件的進一步優化可靠地形 成至多1.3 mM 1-己締。
[0076] 實施例6 1-下締和1-丙締的捕集、衍生化和定量 最初使用手工頂空GC-MS注射證實1-丙締和1-下締的產生。由于使用分析標準品對1- 丙締和1-下締的定量不是可行的，設計了從生物催化反應衍生出的高揮發性的短鏈a-締控 的新捕集/衍生化系統。因而，將建立的反應裝置(參見表3中的反應條件)放大至10 ml (使 用25 ml雙頸燒瓶），并在如圖7所示的裝置中執行下酸(C4)和戊酸(C5)的脫簇。
化學反應路線2:通過OleT-CamAB-抑H級聯將下酸脫簇，隨后在塵埃測定器中用化2將 揮發性的1-丙締衍生化W產生1,2-二漠丙烷作為最終的反應產物。
[0077] 使用1,2-二漠下燒和1,2-二漠丙烷的分析標準品，通過GC-FID和GC-MS分析得到 的產物。由于（肉眼可見的）氣體排出（OleT和FDH產生C〇2)和強烈的DCM蒸發(24 hW后損失 約70%體積），確定在塵埃測定器中的殘余體積W允許可靠的產物定量。制備1,2-二漠下燒 和1,2-二漠丙烷的校正曲線W允許定量產生的1-丙締和1-下締(未顯示）。
[0078] 進一步，將含有1,2-二漠下燒的溶液通過干燥空氣流濃縮至70化1，并通過Ih-NMR 進行分析（圖11)，其充當OleT形成1-下締的另一個證據。類似地，將含有1,2-二漠丙烷的溶 液通過干燥空氣流濃縮至70化1，并通過Ih-NMR進行分析（圖16)，其充當OleT形成丙締的另 一個證據。
[0079] I，2-二漠下燒的分析標準品是Ih NMR (300 MHz, CDC13) 5 4.23 - 4.09 (m, 1H), 3.87 (dd, J = 10.2, 4.4 Hz, IH), 3.66 (t, J = 10.1 Hz, IH), 2.22 (dqd, J =14.6， 7.3， 3.3 Hz, IH), 1.97 - 1.74 (m, IH), 1.09 (t, J = 7.2 Hz,抓)。
[0080] 使用的1，2-二漠丙烷的分析標準品是Ih NMR (300 MHz, CDCb) 5 4.34 - 4.20 (m, IH), 3.87 (dt, J = 10.1, 5.0 Hz, IH), 3.58 (t, J = 10.1 Hz, IH), 1.85 (d, J = 6.6 Hz, 3H)。
[0081] 執行對照反應(沒有OleT的CamAB-抑H級聯）W證實僅當在反應容器中重構完整級 聯時1-丙締和1-下締的產生（圖8和9)。還通過GC-MS證實了 1,2-二漠下燒和1,2-二漠丙烷 的形成(未顯示）。對于新穎的捕集策略，可能鑒別和定量1-丙締和1-下締。10 mM戊酸的轉 化導致834 JiM 1-下締的形成，而對于10 mM下酸的轉化，確定了504 JiM 1-丙締。至少一式 S份地執行所有反應，對應的a-締控是在塵埃測定器溶液中檢測到的唯一反應產物。
[0082] 參考文獻 Belcher, J.，等人，J Biol Chem, 2014. 289(10): P. 6535-50. Busto, E.,等人，Qiemistry, 2014. 20(35): P. 11225-8. &;rte;r J丄丄.，QiemBioQiem 2014, 15, 2710 - 2718 Dudek, H.M.,等人，.J. Biomol. Screen., 2013. 18(6): P. 678-687. Rijishiro T, J Biol Chem 2011， 286:29941-29950. Hannemman F., Biochimica et Biophysica Acta 1770 (2007) 330-344 Koga, H.，等人，J Biochem, 1989. 106巧）：P. 831-6. Liu, Y.,等人，Biotechnology for Biofuels, 2014. 7(28). Malca S.H., et al (2011) Biochimica et Biophysica Acta 1814 257-264 Matsunaga, I.,等人，Archives of Biochemistry and Biophysics, 2001. 394 (1): p. 45-53. Matsunaga I,陽BS Lett 2002, 528:90-94. Nazor, J.,等人，Protein Eng Des Sel, 2008. 21(1): p. 29-35. Roome, P.W., J Biol Qiem, 1983. 258(4): p. 2593-8. Rude, M.A.,等人，.A卵I Environ Microbiol, 2011. 77巧）：p. 1718-27. Schallmey, A.,等人，Appl Microbiol Biotechnol, 2011. 89(5): p. 1475-85. Scheps D, Org. Biomol. Qiem. 9: 6727 -6733 化tis, J.M.，等人，Chem Int Ed Engl, 2002. 41(17): p. 3257-9。
【主權項】
1. 能夠從至少一種短鏈脂肪酸生產至少一種末端烯烴的微生物細胞，其中所述細胞經 過基因修飾以包含 -至少第一個基因突變，其與野生型細胞相比增加選自CYP152過加氧酶家族的酶(E1) 的表達，和 -至少第二個基因突變，其與野生型細胞相比增加至少一種NAD(P)+氧化還原酶(E2) 和對應的調節蛋白的表達， 其中所述短鏈脂肪酸是C4-Ciq脂肪酸。2. 根據權利要求1所述的細胞，其中E1選自CYPSPa、（Ela)CYP BSB (Elb)和OleT (Elc)。3. 根據權利要求1或2中的任一項所述的細胞，其中E1是01eT (Elc)且與SEQ ID NO: 1具 有至少60%序列同一性。4. 根據前述權利要求中的任一項所述的細胞，其中所述NAD (P)+氧化還原酶(E2)和對 應的調節蛋白是： (a) 鐵氧還蛋白還原酶(E2a)和鐵氧還蛋白；或者 (b) 假單孢氧還蛋白還原酶(E2b)和假單孢氧還蛋白。5. 根據前述權利要求中的任一項所述的細胞，其中E2與SEQ ID N0:2具有60%序列同一 性，且所述調節蛋白與SEQ ID NO:3具有60%序列同一性。6. 根據前述權利要求中的任一項所述的細胞，其中所述細胞進一步包含至少第三個基 因突變，其與野生型細胞相比增加至少一種能夠再生NAD(P)H的酶(E 3)的表達。7. 根據權利要求6所述的細胞，其中所述酶(E3)選自葡萄糖脫氫酶、亞磷酸脫氫酶和甲 酸脫氫酶。8. 根據前述權利要求中的任一項所述的細胞，其中所述細胞與野生型細胞相比進一步 包含降低的脂肪酸降解能力。9. 根據權利要求8所述的細胞，其中通過編碼選自以下的酶的基因的缺失來降低所述 脂肪酸降解能力:脂肪酸輸入酶、脂肪酸輔酶A連接酶、酰基輔酶A脫氫酶、2,4_二烯酰輔酶A 還原酶、烯酰輔酶A水合酶和3-酮脂酰基輔酶A硫解酶。10. 根據前述權利要求中的任一項所述的細胞，其中所述細胞是原核或低等真核細胞。11. 一種從至少一種短鏈脂肪酸生產至少一種末端烯烴的方法，所述方法包括 -使根據權利要求1-10中的任一項所述的重組微生物細胞與包含短鏈脂肪酸的介質 接觸。12. 根據權利要求1-10中的任一項所述的細胞用于生產至少一種末端烯烴的用途。
【文檔編號】C12P5/02GK105925518SQ201610104399
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年2月25日
【發明人】A.鄧尼希, K.法貝爾, M.哈爾, T.哈斯, T.比爾特, S.吉爾希, A.蒂森胡森
【申請人】贏創德固賽有限公司