一株空間不動桿菌lct-h3的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株“神舟九號”飛船返回艙中分離得到下行菌株不動桿菌LCT?H3（Acinetobacter sp. LCT?H3），其菌體形態為短桿狀，可利用多種碳源生長，并且可以響應不同濃度的鐵離子，全基因組測序分析其基因組大小為3.13 Mbp，包括2760個編碼序列和74個RNA基因，COG數據庫比對共注釋到21組COG功能分類。對研究密閉飛行器內微生物種類、分布及特點等提供了一定幫助。CGMCC No.1257120160601
【專利說明】
-株空間不動桿菌LCT-H3
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域;更具體地，本發明設及不動桿菌LCT-H3及其生物學特 性、全基因組學測序。
【背景技術】
[0002] 隨著航天技術的發展，人類的外太空探索活動越來越頻繁。在地面上微生物幾乎 無處不在，大多數存在于人類皮膚、口腔、鼻咽部和胃腸道。盡管載人飛船及內部物品等經 過嚴格的真空消毒，載人航天器密閉環境條件下仍然容易滋生細菌和真菌等微生物，運些 微生物能在密閉艙室內的金屬、高分子復合材料等表面形成生物膜，它們的生長繁殖和代 謝會對材料產生腐蝕，嚴重威脅空間站的長期在軌運行安全，縮短空間站的服役時間。研究 密閉航天器內的微生物種類對于航天器內微生物的安全防護具有重要的意義。
[0003] 早期人們對許多環境微生物的認識僅來自于對16S rRNA的研究，一些重要的遺傳 信息很難獲得。現在越來越多的新的培養和分子生物學方法，例如基因組學、蛋白質組學、 宏基因組學等，被用來研究新獲得微生物的潛在特征和功能等。
[0004] 隨著人類基因組計劃的實施和進行，生物體基因組研究已經成為生命科學研究的 前沿領域，而與之相對應的微生物基因組研究正在廣泛開展。細菌是微生物的一種，其基因 組小、操作簡單且實驗周期短，其研究的工作可為人類基因組研究提供有益的參考；同時隨 著測序技術的更新換代和高通量測序技術的出現，細菌基因組的測序成本和所需時間已大 幅度降低。初步研究了該菌的表型及生理生化特征，對研究密閉飛行器內微生物種類分布、 材料的微生物腐蝕等提供了幫助。
【發明內容】
[0005] 本發明的菌株不動桿菌LCT-H3(Acinetobacter SP. LCT-H3)為"神舟九號"飛船 的返回艙內的冷凝水中分離得到。
[0006] 本發明提供的該菌株，其保藏號為CGMCC 12571。
[0007] 菌株LCT-H3可在MH固體平板上形成無色、表面光滑且邊緣整齊菌落。為革蘭氏陰 性菌。菌體呈桿狀，分散排布，無芙膜，無芽抱，表面沒有鞭毛，但有菌毛結構。LCT-冊菌株可 利用多種碳源，包括單糖(葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等）、二糖(龍膽二糖、乳糖、蜜二糖 等），多糖(果膠、糊精等）W及多種無機碳源等，對四環素、慶大霉素、左氧氣沙星、頭抱贓酬 等多種抗生素敏感。在鐵離子缺乏條件下，生長受到明顯抑制。
[000引所述的菌株LCT-冊菌株，進行了全基因組測序，并進行分析，其基因組大小為3.13 Mbp，GC含量為44.3%，包括2760個蛋白編碼基因和74個RNA基因。其中，COG數據庫比對后， 2131個蛋白被分類注釋為21類COG家族。
【附圖說明】
[0011] 圖1菌株LCT-冊的16S rRNA基因序列NJ系統發育樹。
[0012] 圖2菌株LCT-冊的革蘭氏染色結果。
[0013] 圖3菌株LCT-冊的生理生化鑒定分析。
[0014] 圖4菌株LCT-冊的藥敏分析。
[0015] 圖5菌株LCT-冊的透射及掃描電子顯微鏡觀察。
[0016] 圖6菌株LCT-H3在不同鐵離子濃度下的生長曲線。
[0017] 圖7菌株LCT-H3在不同鐵離子濃度下的差異蛋白分析。
【具體實施方式】
[0018] 下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0019] 下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0020] 實施實例一:菌株LCT-冊培養。
[0021] 菌株LCT-H3為"神舟九號"飛船的返回艙內冷凝中分離得到的下行菌株。菌株分 別于37 °C培養箱或搖床中進行靜置或振蕩培養，液體培養基均為LB(Trptone lOg/L， Yeast extract 5g/l, NaCl 5g/l,閒7.3)，固體培養基為MH 平板。
[0022] 實施實例二:菌株LCT-冊菌種鑒定及系統發育樹構建。
[0023] LCT-H3接種至LB液體培養基，37 DC，180 rpm過夜培養，6000 rpm離屯、5 min收集 菌體，棄上清。利用Qiagen公司的基因組DNA提取試劑盒(Code No. 51304,詳細步驟見產 品說明書）提取收集的菌體的基因組DNA。WLCT-H3的基因組DNA為模板，利用細菌16S rRNA 通用巧U 序引 物 27F(5'一 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3'）^ni492R(5'一 TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴增其16s rRNA片段并測序，得到其堿基序列。用CLUSTALW 化1：19://\￥麗.613；[.日。.址/1'0013/1113日/。11131日1￥2/)進行多序列比對，并用1664 5.0構建 NJ系統發育樹(圖1)。
[0024] 實施實例S:菌株LCT-冊的革蘭氏染色。
[00巧]采用革蘭氏染色試劑盒（Code No. G1060, Solarbio)對LCT-H3菌體進行革蘭氏 染色。LB液體培養基過夜培養菌體，將菌液滴于載玻片中央，在酒精燈上略加溫，使之迅速 干燥。結晶紫、沙黃染色液對干燥菌體一次染色脫色，詳細步驟見產品說明書。染色完成并 驚干后，置于光學顯微鏡下觀察染色情況，先用顯微鏡低倍鏡找到目標視野，然后再用油鏡 (IOOX)進行觀察，判定并記錄結果、拍照，見圖2,革蘭氏染色陰性桿菌，呈單個、分散排列。 [00%] 實施實例四：菌株LCT-冊的生理生化鑒定實驗。
[0027] Biolog微孔板(Biolog GENIII MicroPlate, Biolog)用來對LCT-H3菌株進行94 種表型檢測，其中包括71種碳源利用率分析和23種化學敏感性分析。LCT-H3接種至BHI液體 培養基，37。(：，180巧m過夜培養，6000巧m離屯、5 min收集菌體，棄上清。將菌體用IF- B接 種液懸浮并調節至適當濃度(0D600約為0.8，菌體濃度約107~108)，分別取100 Ul接種液加 入Biolog微孔板的96個孔中，將微孔板放置在37 °C培養箱中培養24小時后，進行觀察，見 圖3,同時用酶標儀測定590 nm各孔的吸光度值(0D590)作為輔助結果。
[0028] 實施實例五:菌株LCT-冊的抗生素敏感性檢測。
[0029] LB液體培養基過夜培養菌體，用滅菌的棉簽薩取菌液后涂布MH固體平板，盡可能 地涂布均勻，涂4個平板;粘貼藥敏片或藥敏E-TEST試紙，選擇抗生素進行藥敏試驗，W檢測 菌株對不同抗生素的敏感程度；貼完藥敏片后，將平板放置在37°C下培養18~24h;觀察結 果，將平板取出觀察各藥敏片的抑菌情況，并記錄抑菌圈的大小(直徑cm),其中藥敏片直徑 約為0.6cm。結果見表3和圖4。
[0030] 表3菌株LCT-冊藥敏試驗。
[0031] 實施實例六:菌株LCT-冊的電子顯微鏡觀察。
[0032]分別在透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察菌體形態。1 ml培養 至穩定前期的菌液，6000巧m離屯、5 min收集菌體，棄上清;PBS緩沖液洗涂一次后將菌體懸 浮至合適濃度。菌懸液等體積與4%多聚甲醒+0.5%戊二醒溶液混合，滴在有支持膜的銅網 上，15 min后用濾紙吸取未吸附樣品；吸取憐鶴酸染液小屯、滴在銅網上，染色1 min后用濾 紙吸取未吸附的樣品；樣品干燥后在化ilips EM 400T型透射電子顯微鏡(TEM)下觀察菌體 形態。首先用2.5%戊二醒、PBS緩沖液W及1%餓酸清洗菌體，乙醇梯度脫水并乙酸異戊醋置 換，樣品干燥后做噴金處理(4)，處理好的樣品置于FEI Quanta 200型掃描電鏡下觀察。結 果如圖5所示，菌體形態為桿狀，沒有鞭毛，但有菌毛，透射電鏡下可觀察到深色致密區域。
[0033] 實施實例屯:菌株LCT-冊在不同鐵離子濃度條件下的生長曲線。
[0034] 活化菌株，在15ml試管(4ml培養基）中過夜培養，然后接種至裝有6ml LB液體培養 基和6ml含終濃度200uM DIP(，鐵馨合劑）的LB培養基的15ml試管中，不同時間點取菌液 ISOul，用酶標儀測定630 nm的吸光度值(0D630)。將菌株在兩種培養條件下所得到的OD值 進行平均值的計算，然后再繪制曲線，見圖6,從圖中可看出，培養基中加入200UM DIP后， LCT-冊菌株基本不生長。
[0035] 實施實例八:菌株LCT-冊在不同鐵離子濃度下的差異蛋白分析。
[0036] LB液體培養基培養兩管菌體至穩定前期，無菌條件下6000 g，5 min，4°C離屯、收 集菌體;棄掉上清后，將菌體分別轉移至等體積的LB和含終濃度200UM DIP()的LB培養基 中，培養6小時。6000 g，5 min，4°C離屯、收集菌體，棄上清，用PBS緩沖液重新懸浮菌體并 洗涂一次。加入50ul SDS-PAGE上樣緩沖液重懸上述菌體沉淀，煮沸IOmin ,1000 Og離屯、 lOmin，上清即為全菌體蛋白樣品。將W上蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，電泳結束后 對凝膠進行考馬斯亮藍染色，分離比較差異蛋白條帶，如圖7,可W發現在鐵缺乏的條件下， 出現了 一條差異蛋白條帶，大小約70-80邸a。
[0037] 實施實例九:菌株LCT-冊的基因組測序、組裝及注釋。
[0038] 基因組DNA樣品委托美吉生物有限公司進行全基因組序列測定、基因預測、基因功 能注釋、非編碼RNA預測等工作，序列分析工作委托美吉生物有限公司和上海滿宇生物科技 有限公司共同完成。
[0039] 基因組DNA提取后進行質量鑒定，在濃度和純度達到測序要求后進行全基因組測 序。利用Covaris進行基因組DNA片段化，構建插入片段約300-500 bp的基因組測序文庫， 通過橋式PCR擴增得至化NA簇，然后采用I Ilumina化seq2000測序技術完成該菌株的基因組 掃描測序，獲得約1 Gb的原始測序數據。Illumina HiSeq2000測序得到的原始圖像數據 經過Base化Iling轉化為序列數據，結果WFASTQ文件格式來存儲，包含測序read的序 列信息W及測序質量信息；原始數據經過預處理去除接頭、引物及低質量數據后，利用 SOAPdenovo化ttp://soa P.genomics.org.cn/)拼接軟件對優化序列進行多個Kmer參數 的拼接，得到最優的組裝結果，并運用GapCloser軟件對組裝結果進行局部內桐填充和堿 基校正；分別利用RNAmmer和tRNAscan-SE軟件對基因組中包含的rRNA和tRNA進行預 測J;利用Glimmer 3 .(Khttp://www. cbcb.umd.edu/software/glimmer/)軟件進行基因預 測;利用各種數據庫進行基因功能注釋和分類。
[0040] 關于保藏的LCT-H3菌株的說明 A. 菌種的保藏單位名稱和地址 名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所 B. 交機構保藏的日期 2016年6月1日 C. 保藏機構給予的保藏號 CGMCC No.12571 D. 分類命名 不動桿菌 Acinetobacter sp.o
【主權項】
1. 一株"神舟九號"飛船返回艙中分離得到下行菌株不動桿菌LCT-H3(Acinetobacter sp · LCT-H3)，其保藏號為CGMCC 12571。2. 根據權利要求1所述的下行菌株LCT-H3，其特征在于:為桿狀的革蘭氏陰性菌，分散 排列，菌落直徑約0.5 -1.0 mm，菌落為圓形，無色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，細菌無莢 膜，無芽孢;化學異養細菌，可利用葡萄糖、纖維二糖等多種碳源;對多種抗生素敏感;在鐵 離子缺乏條件下，生長受抑制。3. 根據權利要求1所述的下行菌株LCT-H3,對該菌進行16S rRNA測序，并進行全基因組 測序并進行分析。
【文檔編號】C12R1/01GK105925510SQ201610456292
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】劉長庭, 周宏 , 張學林, 方向群, 姜學革, 郭英華, 劉巖, 徐綢, 潘磊, 李佳, 余昳
【申請人】中國人民解放軍總醫院