一種加巴噴丁的藥物組合物及其醫藥用圖
【專利摘要】本發明公開了一種加巴噴丁的藥物組合物及其醫藥用途，本發明提供的加巴噴丁的藥物組合物中含有加巴噴丁和一種結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，加巴噴丁和該天然產物單獨作用時，對脫發具有治療作用；二者聯合作用時，對脫發的治療效果進一步提高，可以開發成治療脫發的藥物。本發明與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
一種加巴噴丁的藥物組合物及其醫藥用途
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物醫藥領域，涉及加巴噴丁的新用途，具體涉及加巴噴丁的藥物組 合物及其在脫發中的應用。
【背景技術】
[0002] 加巴噴丁在各種動物模型中均顯示預防癲癇的作用，另外，在動物痙攣、鎮痛和肌 萎縮性側索硬化模型中也顯示作用。加巴噴丁對腦組織的新穎結合點有高的親和性，它能 通過氨基酸轉移體通過體內一些屏障，同其它抗驚厥藥相比，加巴噴丁具有較小的行為和 心血管副作用。加巴噴丁對腦組織的新穎結合點有高的親和性，它能通過氨基酸轉移體通 過體內一些屏障，同其他抗驚厥藥相比，加巴噴丁具有較小的行為和心血管副作用。
[0003] 加巴噴丁常用于常規抗癲癇藥不能滿意控制或不能耐受的局限性發作的癲癇患 者，以及局限性發作并繼而全身化的癲癇患者的附加治療。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種加巴噴丁的藥物組合物，該藥物組合物中含有加巴噴 丁和一種結構新穎的天然產物，加巴噴丁和該天然產物可以協同治療脫發。
[0005] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0006] 一種具有下述結構式的化合物（I)，
[0008] -種加巴噴丁的藥物組合物，包括加巴噴丁、如權利要求1所述的化合物（I)和藥 學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0010] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將忍冬藤粉碎，用75~85%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用 大孔樹脂除雜，先用25 %乙醇洗脫8個柱體積，再用70 %乙醇洗脫12個柱體積，收集70 %洗 脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步 驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積 百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得 到化合物(I)。
[0012] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用80%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0013] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0014]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0015] 上述化合物(I)在制備治療脫發的藥物中的應用。
[0016] 上述加巴噴丁的藥物組合物在制備治療脫發的藥物中的應用。
[0017]本發明的優點：
[0018] 本發明提供的加巴噴丁的藥物組合物中含有加巴噴丁和一種結構新穎的天然產 物，加巴噴丁和該天然產物單獨作用時，對脫發具有治療作用；二者聯合作用時，對脫發的 治療效果進一步提高，可以開發成治療脫發的藥物。本發明與現有技術相比具有突出的實 質性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0020] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0021] 分離方法：（a)將忍冬藤(2kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取（15LX3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫 12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (10個柱體積）、45:1 (8個柱體積）、25:1 (10 個柱體積)和15:1 (8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」4個組分；（d)步驟(c)中組分 4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1 (10個柱體積）、15:1 (8個柱體積)和1:1 (6個 柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0022] 結構確證:冊431-]\^顯示[]\?^]+為111/2 549.2308，結合核磁特征可得分子式為 C33H34〇6，不飽和度為 17。核磁共振氫譜數據δΗ(ρρπι，DMS〇-d6，500MHz): H-2 (6 · 47，s)，H-6 (6.42，s)，H-a(6.71，d，J=16.2)，H-0(6.85，d，J=16.2)，H-2'，6'（7.71，d，J = 8.5)，H-3'， 5'（7.12，d，J = 8.5)H-3"（6.49，d，J = 2.3)，H-5"（6.42，dd，J = 8.2,2.3)，H-6"（7.18，d，J = 8·2)，Η-α'（2·34，πι，2Η)，Η-β'（2·21，πι，2Η)，Η-γ，（4.39，t，J = 8.2)，H-2" '，6" '（7.15，d，J = 8.2)，H-3" '，5" '（6.57，d，J = 8.2)，3-0CH3(3.71，s)，4'-0CH3(3.82，s)，2"-0CH 3(3.73， s)，4"-OCH3(3 · 84，s);核磁共振碳譜數據δ。(ppm，DMS〇-d6，125MHz): 130 · 1 (C，1-C)，105 · 6 (CH，2-C)，157.4(C，3-C)，118.8(C，4-C)，157.6(C，5-C)，105.7(CH，6-C)，126.5(CH，a-C)， 127.9(CH，0-C)，137.1(C，1'-C)，128.2(CH，2'，6'-C)，116.1(CH，3'，5'-C)，157.6(C，4'-C)，123.5(C，1"-C)，159.3(C，2"-C)，99.2(CH，3"-C)，157.0(C，4"-C)，107.1(CH，5"-C)， 130.6(CH，6"-C)，29.4(CH 2，a'-C)，34.1(CH2，P'-C)，40.6(CH，γ，-C)，138.0(C，l" '-C)， 129.7(CH，2" '，6" '-C)，114.8(CH，3" '，5" '-C)，155.3(C，4" '-C)，55.7(CH3,3-0CH3)，55.6 (CH3，4 ' -OCH3)，56 · 2 (CH3，2" -OCH3)，55 · 7 (CH3，4" -OCH3)。h-NMR和1H-1!! COSY譜顯示出兩對 雙質子雙峰[SH7.71(2H，d，J = 8.5Hz)，7.12(2H，d，J = 8.5Hz)，7.15(2H，d，J = 8.2Hz)，6.57 (2H，d，J = 8.2Hz)]，表明該化合物含有兩個1，4-二取代芳環。此外，觀察到一組ABX的耦合 信號 SH6.49(lH，d，J = 2.3Hz)，6.42(lH，dd，J = 8.2,2.3Hz)和 7.18(1!1，(1，了 = 8.2!^)，表明 該化合物含有一個1，2，4-三取代芳環。另一對雙質子單峰信號δΗ6.47(1H，s)和6.42(1H， s)，說明含有一個1，3,4,5_四取代芳香環。除了芳族質子，還有兩個反式烯烴質子信號δ !16.71(1!1，(1，1=16.2泡）和6.85(1!1，(1，1=16.2泡），兩個亞甲基脂肪族質子信號[6!12.34 (111，2!0,2.21(111，2!0]，一個次甲基信號[6!14.39(1!1，^ = 8.2抱）]，以及四個甲氧基信號[6 H3.71，3.73,3.82,3.84(3H，s)]。13C-NMR和HSQC譜顯示了 33個碳信號，包括六個含氧季碳， 五個芳香族季碳，十三個芳香族次甲基碳，三個脂族次甲基碳，兩個脂族亞甲基碳，四個甲 氧基碳。HMBC譜中，反式烯烴質子與對-甲氧基苯和四取代苯環的相關性表明該化合物為共 輒芪類化合物。HMBC譜中C-3、C-4和C-5與脂肪族次甲基質子信號的相關性表明chalcane單 元與C-4相連。HMBC譜中各甲氧基信號分別與C-3，C-4 '，C-2"和C-4"的相關性表明(：-3，(：-4 '，C-2"和C-4"各連有一個甲氧基基團。此外，通過HMBC和N0ESY實驗確認了亞甲基碳C-α ' 與三取代苯環的C-Γ相連，C-γ '與對-羥基苯環連接。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜， 以及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD 試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0023]該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0025] 實施例2:藥理作用
[0026]脫發是一種最常見皮膚疾病。長期以來，人們一直致力于尋找和研發治療脫發的 藥物，如糖皮質激素、米諾地爾等。然而到目前為止，尚沒有一種藥物能完全治愈脫發，且存 在較大的不良反應。因此，開發療效確切、無不良反應的防治脫發的藥物具有重要的社會意 義和經濟意義。本實施例采用環磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)建立小鼠脫毛模型，觀察 藥物對改善脫毛小鼠毛發生長的作用。
[0027] 1、材料與方法
[0028] 1.1動物
[0029] SPF級，雄性C57BL/6小鼠，體質量18~20g，上海斯萊克實驗動物有限公司。飼養環 境:室溫控制在24~26°C，光線每12h明暗交替，自由進食，隔日更換墊料。
[0030] 1.2試劑與樣品
[0031] 加巴噴丁購自中國藥品生物制品檢定所。化合物（I)自制，制備方法見實施例1。環 磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）<XBA檢測試劑盒(美國，BD公司）、CD4檢測試劑盒(上 海穎心實驗室設備有限公司）、CD8檢測試劑盒(上海穎心實驗室設備有限公司）。
[0032] 1.3儀器
[0033] JEM-1010型電鏡（日本，日本電子公司）、C6型流式細胞儀(美國，BD公司）、MK3型酶 標儀(美國，Thermo公司）。
[0034] 1.4小鼠分組及模型制備
[0035] C57BL/6小鼠用麻醉機麻醉。麻醉后，將松香和石蠟按1:1的比例混合加熱融化，并 均勻涂抹于項背部，凝固變硬后揭去，誘導生長期毛發，每只小鼠脫毛面積約為2. OcmX 2.0cm。注意不要燙傷小鼠皮膚。脫毛后9天(小鼠背部皮膚誘導生長期毛囊產生），根據隨機 數字表，將小鼠分為5組，每組20只，分別是空白對照組、模型對照組、加巴噴丁組（280mg· kg-0、化合物（I)組(280mg · kg-4、加巴噴丁與化合物（I)組合物組【140mg · kg-1加巴噴丁+ 140mg · kg<化合物（I)】。所有小鼠脫毛區皮下注射CTX150mg/kg后，模型組任其自然生長， 空白對照組給予生理鹽水(l〇〇mg/kg)灌胃治療，其他各組藥物灌胃治療，持續8周。
[0036] 1.5組織取材
[0037] 分別在給藥后1、2、4、8周，每組隨機選取小鼠各5只，行眼眶采血，每只1~2mL。用 于ELISA檢測：每組取2個血樣，加入EDTA抗凝，3000r/min離心30min取上清，于一 20 °C保存 備用。用于流式細胞術檢測:每組取3個血樣，分離血清，于-70°C保存備用。所有動物取血后 立即處死，取其脫毛區域皮膚組織。經10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，石蠟切片，切片厚 4~5ym，-80°C下保存備用。
[0038] 1.6ELISA檢測外周血CD4+、CD8+表達水平
[0039]樣本室溫下平衡20min。設置標準品孔、樣本孔和空白孔。空白孔什么都不加，標準 品孔各加不同濃度的標準品50此。待測樣本先加樣本稀釋液40yL，再加待測樣本10yL，隨后 標準品孔和樣本孔(空白孔不加)加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體l〇〇yL，用封板膜封 住反應孔，37 °C恒溫箱孵育60min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加洗滌液，靜置lmin，甩去 洗滌液，吸水紙上拍干，重復5次。所有孔加入底物A、B各50yL，37°C避光孵育15min。加終止 液50yL，15min內，在450nm波長處測定各孔0D值。統計CD4和CD8的0D值，將CD4/CD8均值作為 結果進行統計分析。
[0040] 1.7統計學方法
[0041] 結果以均數土標準差U±s)表示。采用SPSS17.0統計軟件分析數據，組間比較應 用單因素方差分析。
[0042] 2、實驗結果
[0043] 2.1體質量變化和毛發生長情況
[0044] 小鼠經CTX誘導脫毛至實驗結束，各組小鼠體質量無明顯差異(P>0.05)。脫毛小 鼠經加巴噴丁、化合物（I)、加巴噴丁與化合物（I)組合物給藥后1~2周，各組小鼠脫毛區局 部皮膚由粉色逐漸轉變成灰黑色，小鼠脫毛區皮膚灰黑色區域明顯比模型組和生理鹽水組 要大;給藥至4~8周，各組小鼠脫毛區呈黑色，且有毛發逐漸長出、伸長。給藥組毛發相對于 模型組和生理鹽水組，毛發更為致密。
[0045] 2.2對脫毛小鼠外周血⑶47⑶8+比值表達水平的影響
[0046] 加巴噴丁組、化合物（I)組、加巴噴丁組與化合物（I)組合物組外周血⑶4+/CD8+比 值隨著時間的延長，呈下降趨勢。1、2、3、4周，與模型對照組比，加巴噴丁組與化合物（I)組 合物組外周血⑶47⑶8+比值顯著下降(P<0.01);與模型對照組比，加巴噴丁組、化合物（I) 組外周血CD4+/CD8+比值下降(P<0.05)。
[0047] 試驗結果見表1。
[0048] 表1對脫毛小鼠外周血⑶47⑶8+比值表達水平的影響
[0050] 脫毛模型最常用實驗動物為C57BL/6小鼠，由于其為有色種屬，皮膚顏色隨毛囊的 發育而表現不同的顏色，是研究毛囊發育和再生一種很好的實驗動物。
[0051] 目前關于脫發的病理生理機制尚未明確，可能的原因主要與局部感染、神經毒物、 精神抑郁、內分泌因素等因素相關。近年來隨著遺傳、基因、分子水平的不斷發展，國內外諸 多學者認為脫發主要是一種由T細胞免疫介導的自身免疫性炎癥疾病，由于毛囊異常暴露 于潛在免疫活性的免疫系統，再通過毛囊的抗原物質激活強大的免疫系統，誘發釋放大量 炎癥，繼而引起脫發。CD4+和CD8+T細胞在脫發患者毛囊內及周圍的浸潤是引起毛發脫落的 關鍵，CD8+T細胞一直被認為對毛囊發揮直接的細胞毒作用，而CD4+T細胞起輔助細胞作用， 在脫發的發病過程中兩者是共同發揮作用的。
[0052]加巴噴丁、化合物（I )、加巴噴丁組與化合物（I)組合物維持治療對脫毛小鼠具有 明顯療效，顯著改善了小鼠脫毛區的毛發生長情況，通過下調外周血⑶4+/CD8+比值來發揮 作用，為臨床脫發的藥物治療提供了新的治療方案。其中，加巴噴丁和化合物（I)聯合作用 時，對毛發生長的改善作用效果顯著，優于加巴噴丁或化合物（I)單獨的作用效果，可以開 發成防治脫發的藥物。
[0053]上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物α)，2. -種加巴噴丁的藥物組合物，其特征在于:包括加巴噴丁、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據權利要求2所述的加巴噴丁的藥物組合物，其特征在于:藥學上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據權利要求2所述的加巴噴丁的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將忍 冬藤粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫 12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用80%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。8. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療脫發的藥物中的應用。10. 權利要求2~4任一所述的加巴噴丁的藥物組合物在制備治療脫發的藥物中的應 用。
【文檔編號】A61K31/195GK105949042SQ201610402169
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】王昌榮
【申請人】王昌榮