一種噬菌體的凍干粉膠囊保存方法
【專利摘要】本發明提供了一種噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，將噬菌體液和噬菌體保存保護劑混合均勻，制備成噬菌體凍干粉，凍干粉過篩后分裝于膠囊殼中密封后，得噬菌體膠囊保存。本發明所述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，方法合理，應用方便，噬菌體可以在室溫保存或者冷藏，對保存環境要求低，適應性好，并且可以長期保存。
【專利說明】
一種噬菌體的凍干粉膠囊保存方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術和微生物制品領域，具體地，涉及一種噬菌體的凍干粉膠囊 保存方法。
【背景技術】
[0002] 噬菌體是一類能感染細菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒的總稱，對一些細菌具 有高度的專一性，當噬菌體侵染這些細菌時，可在細菌中繁殖并殺死細菌，而它對動植物沒 有毒性。隨著分子生物學技術的發展，噬菌體已經廣泛用于疾病診斷、水處理等多個領域。 由于噬菌體可以將基因插入宿主DNA內的特性，使得它還成為了重要的分子和遺傳學研究 工具。利用噬菌體，可以設計很多精巧的實驗。
[0003] 然而在上述過程中，都需要對噬菌體進行保存，現有技術的保存方案中噬菌體的 保存效果差，噬菌體的保存時間短，存活率低，噬菌體容易被污染，并且必須在低溫條件下 進行保存，嚴重制約了對噬菌體應用的發展。
【發明內容】
[0004] 發明目的：為了克服以上不足，本發明提供了一種噬菌體的凍干粉膠囊保存方法。
[0005] 技術方案:本發明提供了一種噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，包括以下步驟：
[0006] 1)噬菌體溶液于2-7°C靜置4-8h，出現絮狀沉淀，經過8000-12000r/min離心20-40min；
[0007] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液；
[0008] 3)噬菌體液體積1-2.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑 所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉5-12份、聚乙二醇2-8份、藻蛋白粉0.2-〇. 6份、谷氨酸鈉0.3-0.8份、羧甲基纖維素0.3-0.5份、膨潤土0.08-0.15、氫氧化鋁膠0.03-〇. 18份、棉子糖0.3-1.2份、硫酸鎂0.1-0.6份、氯化鈣0.6-1.2份、硫酸鈉0.3-0.8份、甘露醇 0.5-1.2份、磷酸氫二鉀0.03-0.2份、磷酸二氫鈉0.05-0.3份、甘油0.02-0.08份、二甲基亞 砜0.01-0.04份和水100份；
[0009] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0010] 一級干燥:將上述溶液于-30°C、80-150mT〇rr壓強的真空條件下干燥12-18h;
[0011] 二級干燥：以0. rc/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持 4-8h后得噬菌體凍干粉；
[0012] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下經過200-500目篩后分裝于膠囊殼中密封后， 得噬菌體膠囊保存。
[0013] 本發明所述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，方法合理，應用方便，噬菌體原液中 加入保存保護劑，以凍干粉形式保存，由于冷凍干燥在低溫下進行，因此噬菌體不會發生變 性或失去生物活力，物質中的一些揮發性成分損失很小，干燥在真空下進行，氧氣極少，因 此一些易氧化的物質得到了保護，并且噬菌體能保持原來的性狀，干燥后的凍干粉疏松多 孔，呈海綿狀，加溶媒后噬菌體可以溶解迅速而完全，幾乎立即恢復原來的性狀。凍干粉保 存于膠囊中方便包裝和儲存運輸，且可以在室溫保存或者冷藏，對保存環境要求低，適應性 好，可以長期保存。保存保護劑中脫脂奶粉、聚乙二醇、藻蛋白粉、羧甲基纖維素、膨潤土形 成整個保存保護劑的骨架，防止低分子物質的碳化和氧化，同時保護活性物質不受溫度影 響，使保護劑形成多孔性、疏松的海綿狀物且具有一定的含水量，在凍存過程中保持原有的 構架，從而增加溶解度。此外，多種糖類和鹽使噬菌體保持存活狀態以及對水分起緩解作 用，并且保持電解質濃度。噬菌體保存保護劑可以使噬菌體低溫保存下免受溶液損傷和冰 晶損傷等物理因素的損傷，并且維持噬菌體極高的存活率和活性，使噬菌體的活動處于半 靜止或靜止狀態。此外，保護劑同溶液中的水分子結合，發生水合作用，弱化水的結晶過程 使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成，同時冷凍保護劑可以通過在噬菌體內外維持一定 的摩爾濃度，降低內外未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質的損傷。此外，保護劑 還可以在室溫條件下用于多種噬菌體的保存，適應性好。
[0014] 進一步的，上述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，所述噬菌體保存保護劑以重量 組分計，還包括0.2-0.6份的抗氧化劑，所述抗氧化劑以重量組分計，包括以下組分:維生素 C 2-8份、維生素 E 3-10份、硫脲3-7份、碘化鉀2-5份、硫代硫酸鈉0.3-1份和鉬酸銨0.5-2 份。通過增加抗氧化劑，使噬菌體長期保持溫度的存活狀態，保存效果好。
[0015] 進一步的，上述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，所述噬菌體膠囊在干燥環境下 于室溫或2_7°C保存。在干燥的條件下保存效果更佳，保存時間更久。可以用于多種不同的 噬菌體凍存的使用，適應性好，可以于室溫或者冷藏保存，對環境溫度要求低，并非要求必 須低溫才能保存，即便在15-25Γ的室溫條件下也可以進行噬菌體的保存，可以用于多種情 況下的保存，具有極高的應用前景。
[0016] 進一步的，上述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，所述步驟在4-6%的濕度條件下 完成。4-6%的濕度條件下溶菌活性最佳，保存效果最好。
[0017] 進一步的，上述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，所述噬菌體緩沖液以重量組分 計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8-15份、氯化鈉0.05-0.2份、氯化鉀1 -5份、硫 酸鎂5-20份、磷酸氫二鉀1-3份、磷酸二氫鈉8-12份、明膠0.05-0.1份、水100份，并且調節pH 到7-7.5。噬菌體緩沖液組分合理，使用方便，可以用于噬菌體的溶解和重懸，并且不影響噬 菌體的活性。
[0018] 進一步的，上述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，所述甘油為20%-40 %的甘油。 20 % -40 %的甘油流動性好，易于應用。
[0019] 進一步的，上述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，所述的水為去離子水或純化水。 去離子水或純化水可以保證新型噬菌體保存保護劑和噬菌體緩沖液質量穩定、可控。
[0020] 進一步的，上述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法的制備方法，使用稀鹽酸和/或氫 氧化鈉調節溶液pH。原料來源廣，調節十分方便，并且應用成本低。
[0021] 有益效果:與現有技術相比，本發明具有以下優點:本發明所述的噬菌體的凍干粉 膠囊保存方法，方法合理，應用方便，噬菌體可以在室溫保存或者冷藏，對保存環境要求低， 適應性好，并且可以長期保存。
【具體實施方式】
[0022]下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發明，這些實施例只是為了說明問題， 并不是一種限制。
[0023] 實施例1
[0024] -種分歧桿菌噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，步驟在4%的濕度條件下完成，包括 以下步驟：
[0025] 1)分歧桿菌噬菌體溶液于2°C靜置4h，出現絮狀沉淀，經過8000r/min離心40min;
[0026] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8份、氯化鈉0.05份、氯化鉀1份、硫 酸鎂5份、磷酸氫二鉀1份、磷酸二氫鈉8份、明膠0.05份和去離子水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調節pH到7;
[0027] 3)噬菌體液等體積的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所述氨 基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉5份、聚乙二醇2份、藻蛋白粉0.2份、谷氨酸鈉 0.3份、羧甲基纖維素0.3份、膨潤土 0.08份、氫氧化鋁膠0.03份、棉子糖0.3份、硫酸鎂0.1 份、氯化鈣0.6份、硫酸鈉0.3份、甘露醇0.5份、磷酸氫二鉀0.03份、磷酸二氫鈉0.05份、20 % 甘油0.02份、二甲基亞砜0.01份和去離子水100份；
[0028] 此外，還包括0.2份的抗氧化劑，所述抗氧化劑以重量組分計，包括以下組分:維生 素 C 2份、維生素 E 3份、硫脲3份、碘化鉀2份、硫代硫酸鈉0.3份和鉬酸銨0.5份；
[0029] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0030] 一級干燥:將上述溶液于-30°c、80mT〇rr壓強的真空條件下干燥12h;
[0031] 二級干燥：以0. l°C/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持 4h后得噬菌體凍干粉；
[0032] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下經過200目篩后分裝于膠囊殼中密封后，得噬 菌體膠囊，所述噬菌體膠囊在干燥環境下于2°C保存。
[0033] 實施例2
[0034] -種大腸桿菌噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，步驟在6%的濕度條件下完成，包括 以下步驟：
[0035] 1)大腸桿菌噬菌體溶液于7°C靜置8h，出現絮狀沉淀，經過12000r/min離心20min;
[0036] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽15份、氯化鈉0.2份、氯化鉀5份、硫 酸鎂20份、磷酸氫二鉀3份、磷酸二氫鈉12份、明膠0.1份和純化水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調節pH到7.5;
[0037] 3)噬菌體液體積2.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所 述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉12份、聚乙二醇8份、藻蛋白粉0.6份、谷氨 酸鈉 0.8份、羧甲基纖維素 0.5份、膨潤土 0.15份、氫氧化鋁膠0.18份、棉子糖1.2份、硫酸鎂 0.6份、氯化鈣1.2份、硫酸鈉0.8份、甘露醇1.2份、磷酸氫二鉀0.2份、磷酸二氫鈉0.3份、 40 %甘油0.08份、二甲基亞砜0.04份和純化水100份；
[0038]此外，還包括0.6份的抗氧化劑，所述抗氧化劑以重量組分計，包括以下組分:維生 素 C 8份、維生素 E 10份、硫脲7份、碘化鉀5份、硫代硫酸鈉1份和鉬酸銨2份；
[0039] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0040] -級干燥:將上述溶液于-30°C、150mT〇rr壓強的真空條件下干燥18h;
[0041] 二級干燥：以0. l°C/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持 8h后得噬菌體凍干粉；
[0042] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下經過500目篩后分裝于膠囊殼中密封后，得噬 菌體膠囊，所述噬菌體膠囊在干燥環境下于7°C保存。
[0043] 實施例3
[0044] -種乳桿菌噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，步驟在5%的濕度條件下完成，包括以 下步驟：
[0045] 1)乳桿菌噬菌體溶液于4°C靜置5h，出現絮狀沉淀，經過10000r/min離心30min;
[0046] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽12份、氯化鈉0.09份、氯化鉀3份、 硫酸鎂12份、磷酸氫二鉀2份、磷酸二氫鈉10份、明膠0.08份和去離子水100份，并且使用稀 鹽酸和/或氫氧化鈉調節pH到7.2;
[0047] 3)噬菌體液體積2倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所述 氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉8份、聚乙二醇6份、藻蛋白粉0.4份、谷氨酸 鈉0.6份、羧甲基纖維素0.4份、膨潤土 0.1份、氫氧化鋁膠0.12份、棉子糖0.8份、硫酸鎂0.4 份、氯化鈣0.8份、硫酸鈉0.6份、甘露醇0.9份、磷酸氫二鉀0.1份、磷酸二氫鈉0.2份、30%甘 油0.05份、二甲基亞砜0.02份和去離子水100份；
[0048] 此外，還包括0.4份的抗氧化劑，所述抗氧化劑以重量組分計，包括以下組分:維生 素 C 5份、維生素 E 5份、硫脲5份、碘化鉀3份、硫代硫酸鈉0.8份和鉬酸銨1份；
[0049] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0050] 一級干燥:將上述溶液于-30°c、100mT〇rr壓強的真空條件下干燥16h;
[0051] 二級干燥：以0. TC/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持 6h后得噬菌體凍干粉；
[0052] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下經過300目篩后分裝于膠囊殼中密封后，得噬 菌體膠囊，所述噬菌體膠囊在干燥環境下于5°C保存。
[0053] 實施例4
[0054] 一種溶藻弧菌噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，步驟在6%的濕度條件下完成，包括 以下步驟：
[0055] 1)溶藻弧菌噬菌體溶液于2°C靜置4h，出現絮狀沉淀，經過9000r/min離心40min;
[0056] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8份、氯化鈉0.05份、氯化鉀5份、硫 酸鎂20份、磷酸氫二鉀2份、磷酸二氫鈉10份、明膠0.08份和純化水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調節pH到7;
[0057] 3)噬菌體液體積1.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所 述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉5份、聚乙二醇2份、藻蛋白粉0.6份、谷氨 酸鈉0.8份、羧甲基纖維素0.3份、膨潤土 0.08份、氫氧化鋁膠0.03份、棉子糖1份、硫酸鎂0.2 份、氯化鈣0.8份、硫酸鈉0.3份、甘露醇0.5份、磷酸氫二鉀0.2份、磷酸二氫鈉0.3份40 %甘 油0.08份、二甲基亞砜0.02份和純化水100份；
[0058] 此外，還包括0.3份的抗氧化劑，所述抗氧化劑以重量組分計，包括以下組分:維生 素 C 2份、維生素 E 3份、硫脲7份、碘化鉀5份、硫代硫酸鈉0.5份和鉬酸銨2份；
[0059] 4)預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以l°C/min的速 度降溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持lh;
[0060] 一級干燥:將上述溶液于-30°c、100mT〇rr壓強的真空條件下干燥15h;
[0061] 二級干燥：以0. TC/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持 7h后得噬菌體凍干粉；
[0062] 5)上述噬菌體凍干粉在無菌條件下經過300目篩后分裝于膠囊殼中密封后，得噬 菌體膠囊，所述噬菌體膠囊在干燥環境下于20°C保存。
[0063] 對使用實施例1-4的噬菌體保護劑的保存1、3、6、9個月后的噬菌體污染情況以及 存活率分別進行考察，如表1所示，噬菌體均未污染，并且如圖1所示，噬菌體在9個月內保持 60%以上的存活率。
[0064]表1噬菌體污染情況
[0065]
[0066] 以上所述僅是發明的幾個實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員 來說，在不脫離發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護 范圍。
【主權項】
1. 一種噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，其特征在于:包括以下步驟： 1)噬菌體溶液于2-7°C靜置4-8h，出現絮狀沉淀，經過8000-12000r/min離心20-40min; 2 )向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液； 3) 噬菌體液體積1-2.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻，所述噬菌體保存保護劑所述 氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉5-12份、聚乙二醇2-8份、藻蛋白粉0.2- 0.6份、谷氨酸鈉0.3-0.8份、羧甲基纖維素0.3-0.5份、膨潤土 0.08-0.15、氫氧化鋁膠 0.03-0.18份、棉子糖0.3-1.2份、硫酸鎂0.1-0.6份、氯化鈣0.6-1.2份、硫酸鈉0.3-0.8 份、甘露醇0.5-1.2份、磷酸氫二鉀0.03-0.2份、磷酸二氫鈉0.05-0.3份、甘油0.02-0.08 份、二甲基亞砜0.01-0.04份和水100份； 4) 預降溫:將上述混合溶液冷凍降溫至5°C，并保持30min;進一步以TC/min的速度降 溫到_5°C，并保持30min;再進一步以rC/min的速度降溫到-30°C，并保持Ih; 一級干燥:將上述溶液于-30°(：、80-1501111'〇^壓強的真空條件下干燥12-1811; 二級干燥：以0 . TC/min的速度，加熱上述溶液到25°C，再于上述真空條件下保持4-8h 后得噬菌體凍干粉； 5) 上述噬菌體凍干粉在無菌條件下經過200-500目篩后分裝于膠囊殼中密封后，得噬 菌體膠囊保存。2. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，其特征在于:所述噬菌體保存 保護劑以重量組分計，還包括0.2-0.6份的抗氧化劑，所述抗氧化劑以重量組分計，包括以 下組分:維生素 C 2-8份、維生素 E 3-10份、硫脲3-7份、碘化鉀2-5份、硫代硫酸鈉0.3-1 份和鉬酸銨0.5-2份。3. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，其特征在于:所述噬菌體膠囊 在干燥環境下于室溫或2_7°C保存。4. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，其特征在于:所述步驟在4-6% 的濕度條件下完成。5. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，其特征在于:所述噬菌體緩沖 液以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8-15份、氯化鈉0.05-0.2份、 氯化鉀1-5份、硫酸鎂5-20份、磷酸氫二鉀1-3份、磷酸二氫鈉8-12份、明膠0.05-0.1份、 水100份，并且調節pH到7-7.5。6. 根據權利要求1所述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，其特征在于:所述甘油為20%-40%的甘油。7. 根據權利要求1或5所述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法，其特征在于:所述的水為 去離子水或純化水。8. 根據權利要求5所述的噬菌體的凍干粉膠囊保存方法的制備方法，其特征在于:使用 稀鹽酸和/或氫氧化鈉調節溶液pH。
【文檔編號】C12N7/00GK105950567SQ201610415919
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】許維素, 宋增福, 陳彪
【申請人】蘇州埃瑞特生物技術有限公司