用于增加酵母生物量的方法
【專利摘要】本發明涉及用于增強酵母培養物的生長和增加酵母培養物的生物量的方法。在對數生長期期間加入乙醇增加酵母生物量和從該生物量純化的產物的產量。
【專利說明】用于増加酵母生物量的方法
[0001]發明背景
本發明涉及生物技術和酵母生物量領域。酵母生物量具有許多應用。在食品工業中其被視為極好的蛋白質、核酸和維生素源并且可用于制造面包、葡萄酒和啤酒。在非-食品工業中，例如生物燃料工業中，其用于生產乙醇。對于人類和獸醫醫學其已被開發用于抗生素、有用蛋白和β-葡聚糖的生產。β-葡聚糖是一種生物免疫調節劑，這使其具有引發和激活免疫系統的能力。增加酵母生物量的產量一直是一個挑戰，因此正在開發新的方法和程序以增加酵母生物量的產量。
[0002]發明概述
本發明為用于增加酵母生物量的方法，其包括在包含至少一種發酵性碳源和一種非發酵性碳源的生長培養基中培養酵母細胞。
[0003]上述本發明的概述不意在描述每個公開的實施方案或本發明的每一實現。之后的說明書更具體地例示說明性的實施方案。在整個申請中的若干位置，通過實例的列表提供指導，這些實例可以以各種組合使用。在每種情況下，列舉的列表均僅用作代表組并且不應解釋為排他的列表。
[0004]附圖簡述
圖1顯示發酵罐中釀酒酵母的生長曲線。
[0005]圖2顯示不同培養基濃度時釀酒酵母的生長的圖。
[0006]圖3顯示使用不同的碳源+乙醇時釀酒酵母的生長的圖。
[0007]圖4Α、4Β和4C顯示乙醇-增強的不同酵母菌株的生長的圖。
[0008]圖5顯示使用不同培養基的乙醇-增強的生長曲線的圖。
[0009]圖6顯示酵母生物量中葡聚糖產量的圖。
[0010]說明性實施方案的詳述
酵母生物量的有效生長需要營養同化、能量產生、生物合成和細胞分裂的協調。一旦營養素耗盡至減少生物合成活動的點，酵母通過降低其生長速率響應。沿著這些線路，增加酵母生物量的限制涉及碳源偏好。碳源例如葡萄糖和蔗糖作為優選的能量源被迅速代謝，并且在利用這些糖之后酵母很快進入穩定期，這限制生物量產量和酵母-衍生的天然產物的量。已將這一生長停滯歸因于營養素耗盡和/或氧化應激引起的代謝壓力。分批補料方法的使用僅部分上減輕該問題。(Roc*1 Gomez-Pastor, Roberto Ferez-Torrado , ElenaGarre和Emilia Matallana (2011).Recent Advances in Yeast B1mass Product1n,B1mass - Detect1n , Product1n and Usage (酵母生物量生產的最近進展，生物量--檢測、生產和使用)，Dr.Darko Matovic (Ed.), ISBN: 978-953-307-492-4，
InTech)
本發明以在對數生長早期期間添加乙醇，一種非發酵性碳源，來解決這一問題。向酵母培養物中添加乙醇促進在一種或多種碳源上生長的任何酵母菌株更好生長。在存在添加的乙醇的情況下，酵母繼續生長并且似乎不存在碳源限制的代謝后果。該結果表明當在培養基中同時利用發酵性和非發酵性碳源二者時酵母無壓力生長。進行實驗表明在乙醇存在下酵母在不明顯消耗不可代謝糖的情況下生長。然而，當起子培養物在包含發酵性碳源的培養基中生長并換到包含乙醇作為唯一碳源的培養基時，存在后續的培養物生長。若起子培養物不處于包含發酵性碳源的培養基的條件下，生長不發生。
[0011]—般而言，增加酵母生物量的產量涉及在碳-限制生長條件下向對數早期的酵母，例如釀酒酵母(Saccharomyces cere visiae)的指數生長培養物中添加乙醇。表面上，乙醇作為除培養基中存在的發酵性碳源(葡糖糖、蔗糖，等)外的非發酵性碳源被利用。發酵性碳源在整個生長期產生乙醇，增加代謝和細胞壓力。對數早期添加乙醇導致利用該非發酵性碳源的合成代謝途徑的上調，從而減少來自發酵所產生的產物的壓力。因此，酵母細胞變得有能力同時代謝非發酵性和發酵性碳源，導致增加的生物量產生。
[0012]實施例1
用于Cane Molasses Base Media (CMB)制備的方案改編自Demirci A等人，(J AgricFood Chem.1999 Jun; 47(6): 2496-500)。基于下列成分制備I升CMB:
CMF*7.5mL/L
Na2SO41.13g/L
CaCl2.2Η200.14g/L
MgCl2.6Η200.94g/L
KH2PO43.0g/L
D-生物素0.4mg/L
微量元素溶液lmL/L
微量元素溶液如下制備:
MgSO4.7Η203.0g/L
MnSO4-H2O0.5g/L
NaCl1.0g/L
FeSO4-7H200.lg/L
CoSO4-5H200.18g/L
CaCl2-2H200.08g/L
ZnSO4-7H200.lg/L
CuSO4-5H200.0lg/L
Al2(SO4)3-^H2O0.0lg/L
H3BO30.0lg/L
Na2MoO4-2H200.0lg/L
制備后將溶液過濾滅菌。
[0013]*Cane Molasses Feeding培養基(CMF):
Cane Molasses530g/L
尿素21.7g/L
CaCl2-2H200.14g/L
NH4H2PO44.0g/L
MgCl2-6H200.94g/L
KH2PO43g/L 微量元素溶液lmL/L
*尿素& KH2PO4過濾滅菌&加熱滅菌后加入培養基
在下列實驗中，加入CMB培養基的CMF濃度為原始發表濃度的2-4倍(lx-4x)。
[0014]實施例2
為了在搖瓶中生長，起子培養物在含有50 ml培養基的250 ml燒瓶中建立。該培養物在振蕩培養箱中于30°C和170 rpm生長過夜。通過1:5或1:10稀釋起子培養物以分別得到0.3或0.150的起始0D600來接種實驗培養物。繼續在振蕩培養箱中于30°C和170 rpm孵育培養物。當培養物的0D600達到0.45-0.8時(其通常為從接種之后約兩代)，加入乙醇至2%的濃度。生長培養物并定期獲取額外的0D，持續最多120個小時。
[0015]實施例3
對于分批發酵，使用裝備有Ai rf I οw充氣系統、高效攪拌系統、pH控制和溫度控制的Sartorius B1STAT? Aplus臺面(bench top)反應器。I L工作體積容器裝備有空氣、堿、酸和培養基入口。整個實驗中維持30°C溫度、1.3 Ι/min通氣和400 rpm攪拌。取樣并分析細胞密度以建立釀酒酵母菌株的生長曲線。培養物的樣品在12、24和32小時獲取以分析總生物量產量和葡聚糖含量。
[0016]如圖1中所示，在補充有2%乙醇的CMB-CMF培養基中于發酵罐中生長的釀酒酵母顯示增加的生長速率和延長的生長。具體地，Ix-CMB-CMF + 2%乙醇培養基顯示比僅培養基(對照)改善的生長，而2X-CMB-CMF + 2%乙醇培養基提供比對照甚至更好的生長速率和延長的生長。
[0017]優化生長狀況和生物量體積的一個方法為通過改變發酵性碳源的濃度。圖2顯示在2x、3x和4x CMF/CMF-CMB培養基中生長并在培養時間O小時和4小時的任一添加乙醇的釀酒酵母菌株的生物量結果。
[0018]對于許多不同的碳源均顯示向生長的酵母培養物中添加乙醇的益處。在圖3中，釀酒酵母在包含麥芽糖、乳糖、棉子糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖、纖維二糖及其組合作為碳源并不含(_)或含有(+ )乙醇的培養基中生長。結果表明使用任何碳源向培養物中添加2%乙醇均增加生物量產生。因此，該益處擴展至培養基中利用的任何碳源。
[0019]向生長培養基中添加乙醇的益處還適用于其它酵母菌株，包括，例如，釀酒酵母、白色念珠菌(Ca/3c/ic/a albicans)幻和/O似從。圖4A、4B和4C顯示生長期間添加2%乙醇增加多種酵母菌株的生物量產生。在僅CMF-CMB或補充有氨基酸的CMF-CMB培養基中生長專利(proprietary)釀酒酵母菌株、白色念珠菌和釀酒酵母菌株BY4743和W303-1B。專利菌株和白色念珠菌SC5314的培養物生長22小時，釀酒酵母BY4743和W3031B生長144小時。圖4A顯示22小時時在搖瓶和B1stat發酵罐二者中含有或不含2%乙醇以及IX或2X CMF培養基的專利菌株的生長。其還顯示使用搖瓶方法22小時時-/+ 2%乙醇與IX或2X CMF培養基的SC5314的生長。圖4B和4C分別代表使用搖瓶方法并從0-144小時測量，-/+ 2%乙醇與IX或2X CMF培養基的釀酒酵母W3031B和BY4743的生長曲線。如從數據顯而易見的，乙醇添加顯著增強培養物中的酵母生長。
[0020]使用許多類型的生長培養基中的任一種，乙醇-誘導的生物量產量和生長增加同樣顯而易見。在圖5中，釀酒酵母在2%乙醇和2x CMF.lx CMF.lx CMF +酵母提取物、酵母提取物或酵母合成完全培養基中生長。起子培養物在CMF-CMB培養基中生長過夜。將起子接種物加至如圖5中所標記的各個培養基中以達到一致的起始0D。培養物在振蕩培養箱中于30°(:和170 rpm孵育4-5小時或約2代，然后加入2%乙醇。30°C孵育培養物并在圖5中所示的時間點測量OD6qq ο使用的對照為僅IX CMF和僅2%乙醇。
[0021]如圖6中所示，在乙醇中生長也增加從生物量獲得的β-葡聚糖的產量。增加產量是由增加的生物量以及增加的每克生物量的β-葡聚糖產量所致。起子培養物在CMF-CMB培養基中生長過夜。將起子接種物加至如圖6中所標記的各個培養基中以達到一致的起始OD ο培養物在振蕩培養箱中于30°C和170 rpm孵育4-5小時或約2代，然后加入2%乙醇。將培養物放回30 °C孵育，120小時時測量0D_并收獲培養物。堿提取培養物沉淀的葡聚糖并凍干。測量所提取葡聚糖的干重。使葡聚糖樣品經受針對葡聚糖含量的GEM分析。每OD的葡聚糖產量計算為(GEM葡聚糖%*所提取葡聚糖的干重)/(100*120小時時的0D600)。對于標準釀酒酵母菌株，2%乙醇產生最高產量。然而，在其它條件下0.5%-4%之間的乙醇濃度也為有益的。
[0022]總之，包含糖、二糖、寡糖或多糖并補充有乙醇的培養基中的酵母生長增加生長速率、延長生長、增加產生的生物量并增加酵母生長的特定產物的產量。這一增加在多個酵母菌株、種類和生長培養基中觀察到。該發現有希望增加依賴生長酵母的工業和研究方法的效率，所述生長酵母包括，但不限于，天然酵母產物、酵母產物食品和通過酵母遺傳修飾表達的生物藥物。
[0023]本文引用的所有專利、專利申請和出版物以及電子可得材料的完整公開內容通過引用以其整體結合。當本申請的公開內容與通過引用結合至本文中的任何文獻的公開內容之間存在任何不一致的情況下，應以本申請的公開內容為準。前面的詳述和實施例僅為了清晰的理解而給出。不應從其理解不必要的限制。本發明不限于所顯示和描述的精確細節，因為對本領域技術人員顯而易見的變更將包含在通過權利要求定義的本發明內。
[0024]除非另外指出，表述在說明書和權利要求中如此使用的組分、分子量等等的量的所有數字應理解為在所有情況下受術語“約”修飾。因此，除非另外指示相反，說明書和權利要求中列出的數字參數為可根據本發明尋求獲得的期需性質改變的近似值。至少，并且在不試圖限制權利要求范圍的等同教義的情況下，每個數字參數應至少根據報道的有效數字的數字并通過應用普通舍入技術解釋。
[0025]盡管闡述本發明的廣泛范圍的數值范圍和參數為近似值，具體實例中列出的數值為盡可能精確地報道的。然而，所有數值固有地包含由其各自的檢驗測量中存在的標準差所必然產生的范圍。
【主權項】
1.用于增加酵母生物量的方法，所述方法包括在包含至少一種發酵性碳源和一種非發酵性碳源的生長培養基中培養酵母細胞。2.權利要求1的方法，其中所述非發酵性碳源為乙醇。3.權利要求1或2的方法，其中所述非發酵性碳源的濃度為約0.5%-4%。4.權利要求1的方法，其中所述發酵性碳源的濃度為約0.5%-4%。5.權利要求1的方法，其中所述非發酵性碳源在滯后期、對數期或指數生長后期期間加入。6.增加經工程改造以代謝天然不被代謝的碳源的酵母菌株的生長速率和生物量的方法，所述方法包括在包含非發酵性碳源的培養基中生長所述酵母菌株。7.權利要求6的方法，其中所述不被代謝的碳源為戊糖類、己糖類、二糖類、三糖類、多糖類之一或其組合。8.權利要求1-8的方法，其中在乙醇存在下于24-37°C的不同溫度下生長酵母以最大化期需產物的產量。9.權利要求1-9的方法，其中所述酵母可在乙醇存在下在不同的攪拌和通氣程度下生長以最大化期需產物的產量。
【文檔編號】C12N1/00GK105960451SQ201480063343
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年9月18日
【發明人】P.利普克, U.埃杜帕甘地
【申請人】紐約城市大學研究基金