一組生物標志物的測定方法
【專利摘要】本發明公開了一組生物標志物的測定方法，包括以下步驟：（1）提取與凈化；（2）標準工作溶液的配制；將空白樣品按上述步驟（1）處理，用該空白樣品基質溶液在 2～100 μg/L 范圍內，配制至少三個濃度的生物標志物系列濃度標準工作液；（3）液相色譜- 串聯質譜法（LC-MS/MS）測定。本發明利用分散固相萃取技術，建立了簡便、快速并能有效避免樣品中基質干擾的樣品前處理方法，將此前處理方法結合HPLC-MS/MS 應用于動物組織及尿液中生物標志物的含量的定性確證和定量檢測，方法回收率在74.2%～106.2%之間，平均相對標準偏差（RSD）為6.4%～13.0%，檢出限為20.0 μg/kg, 定量限為50.0 μg/kg，具有操作簡便、快速、準確、靈敏度高及重復性好的優點。
【專利說明】一組生物標志物的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一組生物標志物的測定方法，更具體地說是采用高效液相色譜-串聯 質譜（LC-MS/MS)定性定量測定生物組織或尿液品中的生物標志物含量的方法，屬于生物 標志物測定【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著溴氰菊酯使用范圍的不斷擴大，溴氰菊酯的毒理研究亦從單純的選 擇低等生物為實驗對象研究神經毒性作用機制，擴展到對哺乳動物的三致作用、代謝過程 等多層次的研究。為評估其生態風險，需要發展用于生物亞致死效應的指示參數來更為準 確地評估和預測其對環境生物的毒害情況許多研究者首先從生物化學方面探索反應污染 物對生物早期的影響參數，其中生物標志物法因為測定指標全面、準確且系統，而得到普遍 認可。生物標志物通常分為三類：即暴露標志物、效應標志物和易感性標志物。在選擇合適 的生物標志物時，有時需要綜合分析，權衡利弊，采取一組綜合的評價指標。
[0003] 溴氰菊酯，分子式C22H19Br2N03，分子量505. 20,結構式如下：
[0004]
【權利要求】
1. 一組生物標志物的測定方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取與凈化 樣品制備動物肉、動物肝樣品經均質制樣機充分粉碎，-20°c避光保存；動物尿樣品冰 箱中-20°C避光保存，樣品使用前避光解凍： a) 動物肉樣品：稱取樣品2. 00±0.Olg，加基質分散固相萃取劑研磨至色澤均一，轉移 至50mL聚丙烯離心管中，準確加入IOmL提取液和10μL抗氧劑溶液，渦旋IOs后用細胞 破碎儀超聲提取5min，8000r/min離心5min，將上清液轉移至另一潔凈聚丙烯離心管中； 殘渣加入5mL提取液，重復提取一次，合并上清液，將合并后的上清液4°C10000r/min離心 5min，所得上清液于40°C下氮氣吹至近干；用乙腈水（1:9)定容至lmL，定溶液渦旋后轉移 至2mLEP管中，4°C12000r/min離心lOmin，吸取上層清液至棕色進樣小瓶，HPLC-MS/MS分 析； b) 肝臟樣品：稱取樣品2. 00±0.Olg，加基質分散固相萃取劑研磨至色澤均一，轉移至 50mL聚丙烯離心管中，準確加入IOmL提取液和10μL抗氧劑溶液，渦旋IOs后用細胞破碎 儀超聲提取5min，8000r/min離心5min，將上清液轉移至另一潔凈聚丙烯離心管中；殘渣加 入5mL提取液，重復提取一次，合并上清液，將合并后的上清液4°ClOOOOr/min離心5min， 所得上清液于40°C下氮氣濃縮至2mL左右，加入5X2mL乙腈飽和正己烷脫脂2次，離心，將 棄去正己烷后的提取液繼續40°C下氮氣濃縮至近干；用乙腈：水（1:9)定容至lmL，渦旋后 轉移至2mLEP管中，4°C12000r/min離心10min，吸取上層清液至棕色進樣小瓶，HPLC-MS/ MS進樣分析； c) 尿液樣品：用移液槍取I.OmL動物尿樣品于50mL聚丙烯離心管中，用甲酸銨緩沖 液調節至中性，加入10μL抗氧劑和ImL甲醇，潤旋30s后8000r/min離心5min，轉出上清 液，加5mL正己烷脫脂2次后，加載至事先用甲醇和水活化好的HLB小柱，接取流出樣液， 4°C12000r/min離心IOmin,吸取上清液進棕色進樣小瓶，HPLC-MS/MS分析； (2) 標準工作溶液的配制 將空白樣品按上述步驟（1)處理，用該空白樣品基質溶液在2?100μg/L范圍內，配 制至少三個濃度的生物標志物系列濃度標準工作液； ⑶液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS)測定 將步驟（2)中的各濃度梯度的標準工作液進行LC-MS/MS測定，以標準工作液的色譜 峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準工作曲線；在相同條件下將步驟（1)中凈化 后的樣品液注入LC-MS/MS進行測定，測得樣品液中生物標志物的色譜峰面積，代入標準曲 線，得到樣品液中生物標志物含量，然后根據樣品液所代表試樣的質量計算得到樣品中生 物標志物含量。
2. 根據權利要求1所述的一種樣品中生物標志物含量的測定方法，其特征在于，步驟 (1)中基質分散固相萃取劑是十八烷基硅烷鍵合相（C18),每克樣品中C18加入量為50mg。
3. 根據權利要求1或2所述的一種樣品中生物標志物含量的測定方法，其特征在于，步 驟（1)中提取溶液為含易揮發有機酸的乙腈水溶液。
4. 根據權利要求1所述的一種樣品中生物標志物含量的測定方法，其特征在于，步驟 (1)中抗氧劑是維生素C。
5. 根據權利要求1所述的一種生物標志物含量的測定方法，其特征在于，步驟（1)中樣 品凈化過程中氮吹至近干后，定容液乙腈-水的比例與初始流動相一致。
6. 據權利要求1所述的一種生物標志物含量的測定方法，其特征在于，步驟（3)中液相 色譜的流動相A為乙腈；流動相B為體積比是0. 1 %的甲酸水溶液。
7. 根據權利要求6所述的一種生物標志物含量的測定方法，其特征在于，步驟（3)中液 相色譜使用梯度洗脫的方法，梯度洗脫的程序是：
8. 根據權利要求1所述的一種生物標志物含量的測定方法，其特征在于，步驟（3)中液 相色譜的色譜柱填料為C18,粒徑為3μπι;步驟（3)中質譜檢測使用電噴霧質譜檢測，電噴 霧電壓：+5500V&-4500V;電離方式：ESI+&ESI_;正負離子同時掃描；離子源溫度：550°C;霧 化氣壓力：〇· 31MPa;氣簾氣壓力：0· 207MPa;輔助氣壓力：0· 369MPa。
9. 根據權利要求1所述的一種生物標志物含量的測定方法，其特征在于，所述的生 物標志物是IR, 3R-二溴菊酸[lR-cis) _3_ (2, 2-dibromoethenyl) -2, 2-dimethylcyclo propanecarboxylicacid]、3_ 苯氧基苯甲酸（3-phenoxybenzoicacid，3_PBA)、8-輕 基脫氧鳥苷（8H3HdG)、6-甲氧基鳥噪呤（6_Methoxyguanine)、5-輕基色胺（Serotonin hydrochloride，5-HT)、5-羥吲哚乙酸（5-HYDR0XYIND0LE-3-ACETICACID，5-HIAA)、 3-硝基丙酸（3-NITR0PR0PI0NICACID，3-NPA)、多巴胺（3-Hydroxytyramine，DA)、腎上 腺素（L(-)-Epin印hrine，EP)、還原型谷胱甘肽（GSH)、氧化型谷胱甘肽（GSSG)、維生素 C(L(+)-Ascorbicacid,VC)〇
10. 根據權利要求9所述的一種生物標志物含量的測定方法，其特征在于，步驟（3)中 質譜檢測使用多反應監測（MRM)掃描模式，各生物標志物的母、子離子及MRM監測條件為：
【文檔編號】G01N30/88GK104458988SQ201410705215
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月27日 優先權日:2014年11月27日
【發明者】曹文卿, 靜平, 李建軍, 林黎明, 楊桂朋, 封立平 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心