一組區分鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量pcr引物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一組區分鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量PCR引物，利用鴨圓環病毒基因型（基因1型和基因2型）復制相關蛋白（Rep）基因編碼區特征性核苷酸GC含量差異來設計。利用本組引物對對鴨圓環病毒基因型進行實時熒光定量PCR反應均可有效擴增，但其在鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量PCR反應后生成的溶解曲線存在溫度差異（Tm值差異）來對鴨圓環病毒的基因型進行有效區分。配合和實時熒光定量PCR儀器連接的電腦并利用儀器自帶的分析軟件，可達到僅需一組引物，即可特異性的對不同基因型（基因1型和基因2型）鴨圓環病毒感染情況進行鑒別診斷。本發明鑒定方法簡單，效率和準確率較高。
【專利說明】
一組區分鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量PCR引物
技術領域
[0001]本發明屬于動物分子病原學領域，具體涉及一組區分鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量PCR引物。【背景技術】
[0002]鴨感染圓環病毒(duck circovirus，DuCV)最早由德國學者Hattermann等2003年首次報道。鴨圓環病毒國內最早傅光華等報道(DuCV-MH25株，GenBank號EF451157)。隨后國內多家單位對鴨感染鴨圓環病毒研究發現，鴨群感染圓環病毒見有以生長不良、羽毛紊亂、 體況消瘦等臨床表征，多品種鴨群均建有感染報道(番鴨、半番鴨感染率稍高)，并表現出和鴨群其他常見病原的混合感染和多重感染現象。
[0003]通過對國內外的鴨圓環病毒分離株的基因組序列進行分析發現，鴨圓環病毒可以被分為不同的基因型和基因亞型。目前，比較公認的是可將鴨圓環病毒分為2個大的基因型:基因1型(DuCV-1)和基因2型(DuCV-2)。本發明公開了一組區分鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量PCR引物的方法，即是用于在鴨圓環病毒基因型(基因1型和基因2型)的鑒別診斷研究。當前，已經見有鴨圓環病毒基因型(基因1型和基因2型)的PCR鑒別診斷方法，該方法使用2組引物對(4條引物)(Li Z, Wang X，Zhang R, et al.Evidence of possible vertical transmiss1n of duck circovirus.Vet Microb1l.2014, 174(1-2):229-232.)〇
[0004]本發明的一組區分鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量PCR引物僅需1組引物對(2 條引物)即可有效對鴨圓環病毒基因型(基因1型和基因2型)進行有效區分。該引物的設計鴨圓環病毒基因型(基因1型和基因2型)復制相關蛋白(Rep)基因編碼區特征性核苷酸GC含量差異來設計，利用實時熒光定量PCR反應后生成的溶解曲線的Tm值和核苷酸GC含量正相關的特點，通過觀察鴨圓環病毒基因型(基因1型和基因2型)經改組引物進行實時熒光定量 PCR擴增反應后的Tm值差異，即可精確對鴨圓環病毒(基因1型和基因2型)感染情況進行準確鑒別診斷，本發明可填補相關領域空白。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一組區分鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量PCR引物及其應用，該引物能有效區分基因1型和基因2型鴨圓環病毒感染(或共感染)，為鴨群健康養殖提供技術保證。
[0006]本發明根據鴨圓環病毒(基因1型和基因2型)復制相關蛋白(Rep)基因編碼區特征性核苷酸GC含量差異來設計一組實時熒光定量PCR引物。該引物針對鴨圓環病毒(基因1型和基因2型)進行PCR擴增均可得到特異性目的條帶，用常規PCR無法對鴨圓環病毒(基因1型和基因2型)感染情況進行鑒別診斷，但在該擴增區域鴨圓環病毒(基因1型和基因2型)存在核苷酸GC含量差異，通過建立基于Eva Green實時熒光定量PCR方法對鴨圓環病毒(基因1型和基因2型)實時熒光定量擴增反應后的生成的溶解曲線存在不同的特異峰值(Tm值)，根據溶解曲線Tm值差異可直接對鴨圓環病毒(基因1型和基因2型)感染情況進行可視化鑒別診斷觀察。
[0007]本發明采用以下技術方案:一組用于可視化檢測的實時熒光定量PCR引物，所述實時熒光定量PCR引物F1和R1的序列為:上游引物 Fl:5’_ CACGCTCGACAATTGCAAGTT -3’，下游引物 Rl:5’_ CAGATCCCCGGGCACGAGA -3'
[0008]通過所述引物建立基于Eva Green實時熒光定量PCR方法，根據利用該引物擴增的鴨圓環病毒(基因1型和基因2型)復制相關蛋白(Rep)基因編碼區特征性核苷酸GC含量差異導致實時熒光定量擴增反應后的生成的溶解曲線存在不同的特異峰值(Tm值)，可直接對鴨圓環病毒(基因1型和基因2型)感染進行鑒別。
[0009]具體包括以下步驟:(1)提取基因1型鴨圓環病毒(DuCV-1)(鴨圓環病毒MH25株，GenBank號EF451157 )和基因2型(DuCV-2)鴨圓環病毒(鴨圓環病毒FQ312株，GenBank號GQ423745)基因組DNA。利用針對基因1型和基因2型鴨圓環病毒復制相關蛋白(Rep)基因編碼區的引物(RepF: 5’-CAATGGCGAAGAGCGGCAACTACT -3’和RepR: 5’- AGCTGCCCAAGTGTITAATCCCT -3’)對其進行特異性PCR擴增，將PCR擴增的目的片段進行膠回收后克隆到T載體上，獲得含有基因1型和基因2型鴨圓環病毒復制相關蛋白(Rep)基因編碼區的陽性重組質粒(T-DuCV-1和T-DuCV-2)，測定其0D值后，做為實時熒光定量PCR方法的標準品。
[0010](2)用所述實時熒光定量引物F1和R2對基因1型和基因2型鴨圓環病毒復制相關蛋白(Rep)基因編碼區的陽性重組質粒(T-DuCV-1和T-DuCV-2)進行Eva Green實時熒光定量 PCR擴增，反應完成后獲得相應的擴增曲線并生成Eva Green實時熒光定量PCR擴增的溶解曲線；(3)實時熒光定量PCR反應結束后，通過觀察擴增曲線判斷鴨圓環病毒感染情況;通過觀察溶解曲線可對DuCV-1和DuCV-2根據其Tm值差異進行鑒別。
[0011]所述PCR引物在檢測不同鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)感染情況方面的應用。[0〇12]其中，設計的實時熒光定量PCR引物需滿足如下要求:(1)、該實時熒光定量PCR產物需選擇不同鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)基因組進行分析后保守的區域設計，以便僅需一組引物能對不同鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和 DuCV-2)進行擴增，即觀察實時熒光定量PCR反應后的擴增曲線即可對鴨圓環病毒感染進行判斷(但無法區分基因型)。
[0013](2)、該組引物對不同鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)的擴增區域存在核苷酸序列存在GC含量差異。基于實時熒光定量PCR反應生成的溶解曲線存在Tm峰值差異，即觀察實時熒光定量PCR反應后的溶解曲線即可對不同鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)感染進行判斷(可有效區分DuCV-1和DuCV-2)。[〇〇14]其中，所述的步驟(2)的峰值如下:若在1'111=(90.52±0.08)°(:出現單一的特異性峰判為基因1型鴨圓環病毒(011(^-1)陽性;若在Tm=(88.92±0.13)°C出現單一的特異性峰判為基因2型鴨圓環病毒(DuCV-2)陽性； 其他情況均判為陰性。
[0015]本發明的有益效果:鑒定方法簡單，效率和準確率較高。使用本研究提供的一組實時熒光定量PCR引物對前期鑒定的2株基因1型鴨圓環病毒和4株基因2型鴨圓環病毒進行檢測，均和預期相符。且僅需1組引物對(2條引物)即可有效對鴨圓環病毒基因型(基因1型和基因2型)進行有效區分。對臨床送檢的9份生長不良番鴨進行檢測后發現，鴨圓環病毒感染的有5株，其中基因1型鴨圓環病毒感染的有1株、基因2型鴨圓環病毒感染的有4株，未檢測到臨床送檢的9份生長不良番鴨存在鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)共感染現象。【附圖說明】[〇〇16] 圖1特異性實時熒光定量PCR引物對不同鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)的 PCR擴增;M: DL2000分子量標準；1: DuCV-1; 2: DuCV-2; 3:陰性對照。[〇〇17]圖2特異性實時熒光定量PCR引物對不同鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)進行檢測的擴增曲線(DuCV-1和DuCV-2差異僅僅是為了便于觀察，如果拷貝數相同，則DuCV-1 和DuCV-2擴增曲線一致。也可作為實驗成功的對照，即沒有擴增曲線，溶解曲線的檢測結果沒有意義)。
[0018]圖3特異性實時熒光定量PCR引物對不同鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)進行檢測的溶解曲線。【具體實施方式】
[0019]下面實施例對本發明做進一步的描述。
[0020]實施例1 1、毒株:基因1型鴨圓環病毒(DuCV-1)(鴨圓環病毒MH25株，GenBank號EF451157)和基因2型 (DuCV-2)鴨圓環病毒(鴨圓環病毒FQ312株，GenBank號GQ423745)均由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所鑒定和保存。
[0021]2、引物設計與合成根據不同鴨圓環病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)復制相關蛋白基因編碼區特征區域設計實時熒光定量PCR反應的引物F1和R1，其中F1和R1引物序列為:上游引物F1: 5 ’ - CACGCTCGACAATTGCAAGTT -3 ’，下游引物R1:5 ’ - CAGATCCCCGGGCACGAGA -3 ’。[〇〇22]3、實時熒光定量PCR標準品的構建以常規方法提取基因1型鴨圓環病毒(DuCV-1)(鴨圓環病毒MH25株，GenBank號 EF451157)和基因2型(DuCV-2)鴨圓環病毒(鴨圓環病毒FQ312株，GenBank號GQ423745)基因組DNA。利用針對基因1型和基因2型鴨圓環病毒復制相關蛋白(Rep)基因編碼區的引物 (RepF: 5’-CAATGGCGAAGAGCGGCAACTACT -3’和RepR: 5’- AGCTGCCCAAGTGTTTAATCCCT -3’)對其進行特異性PCR擴增，將PCR擴增的目的片段進行膠回收后克隆到T載體上，獲得含有基因1型和基因2型鴨圓環病毒復制相關蛋白(Rep)基因編碼區的陽性重組質粒(T-DuCV-1和T-DuCV-2)，測定其0D值后，做為實時熒光定量PCR方法的標準品。[〇〇23]4、實時熒光定量PCR反應優化出的20 yL最佳反應體系為體系:Eva Green 10此、上、下游引物(10 wnol/L)各0.2此、模板2此、水補足至20此。最佳反應條件為:95 °C，2 min預變性;95 °C 10 s， 64 °C 15 s，共40個循環，循環結束后，做出溶解曲線。[〇〇24]4、實時熒光定量PCR溶解曲線實時熒光定量PCR反應結束后，觀察擴增曲線，判斷建立的方法有無特異性擴增(沒有擴增曲線，溶解曲線的檢測結果沒有意義)。實時熒光定量PCR反應結束后做出的溶解曲線， 直接在和實時熒光定量PCR儀器連接的電腦上軟件進行分析，對不同鴨圓環病毒基因型 (DuCV-1和DuCV-2)感染情況進行判斷，判斷方法為:若在1'111=(90.52±0.08)°(:出現單一的特異性峰判為基因1型鴨圓環病毒(011(^-1)陽性;若在Tm=(88.92±0.13)°C出現單一的特異性峰判為基因2型鴨圓環病毒(DuCV-2)陽性； 其他情況均判為陰性。[〇〇25]5、臨床應用使用本研究提供的一組實時熒光定量PCR引物對前期鑒定的2株基因1型鴨圓環病毒和 4株基因2型鴨圓環病毒進行檢測，均和預期相符。對臨床送檢的9份生長不良番鴨進行檢測后發現，鴨圓環病毒感染的有5株，其中基因1型鴨圓環病毒感染的有1株、基因2型鴨圓環病毒感染的有4株，未檢測到臨床送檢的9份生長不良番鴨存在鴨圓環病毒兩個基因型(DuCV-1和DuCV-2)共感染現象。
[0026]另外，將上述鑒定為基因1型鴨圓環病毒感染的有1株、基因2型鴨圓環病毒感染的有4株的5株鴨圓環病毒，用文獻鴨圓環病毒基因型(基因1型和基因2型)的PCR鑒別診斷方法，該方法使用2組引物對(4條引物)(Li Z, Wang X，Zhang R, et al.Evidence of possible vertical transmiss1n of duck circovirus.Vet Microb1l.2014, 174 (1-2): 229-232.)進行檢測方法，結果一致，符合率為100%。此外，和文獻[姜世金，李志國， 王鑫，張瑞華為發明人申請的國家發明專利一種快速鑒定鴨圓環病毒基因型的雙重PCR方法，201410323308.X(已授權)]介紹的方法對的9份生長不良番鴨進行檢測后發現，鴨圓環病毒感染的有5株，其中基因1型鴨圓環病毒感染的有1株、基因2型鴨圓環病毒感染的有4 株，未檢測到臨床送檢的9份生長不良番鴨存在鴨圓環病毒兩個基因型(DuCV-1和DuCV-2) 共感染現象，結果和本研究建立的方法符合率為100%。
[0027]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一組區分鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量PCR引物，其特征在于:所述PCR引物序 列為:上游引物F1: 5 ’ - CACGCTCGACAAITGCAAGIT -3 ’，下游引物R1:5 ’ - CAGATCCCCGGGCACGAGA -3 ’。2.如權利要求1所述一組區分鴨圓環病毒基因型的實時熒光定量PCR引物在制備區分 鴨圓環病毒基因型試劑盒上的應用。3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述的鴨圓環病毒基因型為基因1型和基 因2型。
【文檔編號】C12N15/11GK105969914SQ201610591795
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月26日
【發明人】萬春和, 黃瑜, 程龍飛, 傅光華, 施少華, 陳紅梅, 傅秋玲, 劉榮昌
【申請人】福建省農業科學院畜牧獸醫研究所