專利名稱：：定性、定量檢測藍舌病毒的引物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用分子生物學方法對病毒進行定性、定量檢測的引物和探針，特別是涉及用實時熒光定量PCR(real-timefluorescentquantificationPCR，real-timeFQPCR)技術對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針。
背景技術：
：藍舌病是世界動物衛生組織(OIE)確認的15種A類動物疾病之一，受到了全世界有關國家的特別關注。藍舌病最早發生于南非(19世紀后期)，進入20世紀后，該病在世界各地陸續發生或查出該病病毒。我國自1979年在云南師宗縣首次發生該病以來，又先后在其它地區多次發生。藍舌病毒(bluetonguevirus,BTV)是感染家養及野生反芻動物的蟲媒病毒。BTV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)環狀病毒屬(Orbivirus)的代表成員，迄今已發現25個BTV血清型(DaviesFG，MuugaiJN，PiniA.VetMicrobiol1992;31:25-32)，其中在美國查出6個血清型(BTV2，10，11，13、17及24)，在我國査出1個血清型(BTV10)。BTV基因組含10個節段的雙鏈RNA(dsRNA)，按大中小分片段1-3為長片段，片段4-6為中長片段，片段7-10為短片段。該10個節段的dsRNA分別編碼7個結構蛋白(VPl、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、VP7)和3個非結構蛋白(NS1、NS2、NS3)。其中NSl由片段6(segment6，S6)編碼翻譯，屬中長大小的dsRNA片段，是與BTV復制有關的一種非結構蛋白。WangLF等的研究表明，NSl基因(又稱S6)在BTV血清群的10個節段基因中最為保守(WangLF，Diorh，0sburnBI.NucleicAcidRes1989;17:8002)。Jonathan等提出BTVNSl基因與其它環狀病毒屬交叉反應最小(JonathanBK，GaryAG,DavidAA,KarlAA&KathryanMM，AmJVetRes,54(1993)2021)。可根據發病癥狀、流行病學和病理剖檢變化對藍舌病進行假定診斷，確診則必須依靠病毒的分離和鑒定或特異性血清學試驗。國際通用的診斷方法是采用瓊脂免疫擴散、熒光抗體或補體結合試驗檢測特異性抗體。中和試驗、競爭性ELISA、間接ELISA也可用于檢測特異性抗體。此外，PCR技術可用于該病毒的基因檢測。PCR技術作為新型的基因檢測手段，具有快速、準確、特異性強等特點，已成為病毒檢測方法發展的必然趨勢。PCR技術自1989年開始應用以來，不僅在分子生物學領域成為常規的方法和手段，而且在遺傳性疾病的診斷、病原體的檢測、法醫學標本的鑒定等多方面得到了廣泛的應用。并且該項技術不斷得到改進。1996年，美國AppliedBiosystems公司推出了實時熒光定量PCR(real-timefluorescentquantificationPCR，real-timeFQPCR)技術，該技術是在常規PCR基礎上加入熒光標記來進行定量，不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、無污染(無需使用溴化乙淀)、自動化程度高等特點。該技術是將DNA探針連接熒光試劑，待此DNA探針與PCR產物結合后，通過檢測熒光光量，并用計算機軟件進行輔助分析，進行量化計算，靈敏度為O.1%。定量PCR不僅可以應用在基礎研究、臨床檢測，還可以在海關及食品衛生檢疫方面發揮重要的作用。實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入一對引物的同時加入一個特異性熒光探針(TaqMan探針)，探針只與模板特異結合，其結合位點位于兩條引物之間，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程。目前常用的Taqraan熒光探針為寡核苷酸，其5'端標記有報告熒光基團(R印orter，R)，如FAM、VIC等，3'端標記有淬滅熒光基團(Quencher,Q)，如TAMRA等。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，故檢測不到熒光；在PCR擴增過程中，Taq酶的5'—3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。在PCR擴增過程中，每經過一個PCR循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程，每個循環結束后檢測一次熒光強度，整個反應結束后，便可得到一條擴增曲線，由已知濃度標準樣品的擴增曲線可以得到一條標準曲線，根據該標準曲線以及未知模板的擴增曲線可對未知模板進行定量分析。但是，目前尚沒有專門用于藍舌病毒基因的實時熒光定量PCR檢測技術，因為沒有合適的引物和特異性熒光探針。
發明內容本發明的目的是提供一對用于對藍舌病毒(BTV)進行定性、定量檢測的引物。本發明所提供的引物，其上游引物具有序列表中的SEQIDNa:1，下游引物具有序列表中的SEQIDN2:2。將上游引物命名為P(NS1-1)，序列表中的SEQIDN2:1由21個堿基組成，該序列位于BTVNS1基因(又稱S6基因)自5，端第10-30堿基;將下游引物命名為P(NS1-2)，SEQIDNa:2由21個堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5，端第110-130位堿基的反向互補序列。所述NS1基因指含有5'端非編碼區核苷酸序列的全基因。由上述引物衍生的引物序列也屬于本發明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQIDNa:l和/或SEQIDNa:2的基礎上經過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。上述引物既適用于藍舌病毒各血清型的實時熒光定量PCR檢測中，也可用于該病毒的常規PCR檢測技術中，其檢測的對象是BTV的NS1基因。若以待測樣品經反轉錄形成的cDNA為模板，在上述引物的引導下進行PCR擴增，擴增產物中有121bp大小的條帶，則樣品中含有BTV。本發明還提供了用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的TaqMan探針。本發明所提供的TaqMan探針，可具有序列表中SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的DNA序列；所述探針為經過熒光標記的，其5'端標記有報告熒光基團，3'端標記有淬滅熒光基團。所述報告熒光基團可為FAM、VIC等，熒光淬滅基團可為TAMRA、MGB等。為防止PCR擴增時被延伸，所述探針的3'端要經過磷酸化處理。將具有序列表中SEQIDNO:3的TaqMan探針命名為T叫ManProbel(NS1)，序列表中的SEQIDN2:3由25個堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5'端第70-94位堿基的反向互補序列；將具有序列表中SEQIDNO:4的TaqMan探針命名為TaqManProbe2(NSl)，序列表中的SEQIDNa:4由23個堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5，端第72-94位堿基。上述TaqMan探針序列的衍生序列也屬于本發明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQIDNq:3或SEQIDNs:4的基礎上，在序列的5'端和/或3，端再添加、減少一個或多個堿基得到的序列。本發明的第三個目的是提供一種檢測藍舌病毒的實時熒光定量PCR試劑盒。本發明所提供的檢測藍舌病毒的實時熒光定量PCR試劑盒，可包括用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針。本發明提供了用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物和TaqMan探針，通過提取待測樣品的總RNA，并通過逆轉錄得到cDNA，再結合實時熒光定量PCR檢測技術，可達到準確定量待測標本中藍舌病毒RNA的目的。本發明所提供的引物及探針可用于臨床及科研中對感染藍舌病的動物中的藍舌病毒RNA進行定性及定量分析，對判斷藍舌病的發生、復發，治療效果評價及病情的動態觀察具有重要意義。本發明將在動物醫學檢測領域發揮重要作用。下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。圖1為BTV-3、5、8、10、11、21、22、(A)樣品PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖2為菌落PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖3為陽性克隆質粒pGEM-T120的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖4A為不同稀釋度的pGEM-T120標準品的實時熒光定量PCR擴增曲線圖4B為6種BTV血清型樣品的實時熒光定量PCR擴增曲線圖5為檢測BTV的實時熒光定量PCR標準曲線以及6種BTV血清型的樣品在標準曲線上的位點圖6為2種其它BTV血清型樣品的實時熒光定量PCR擴增曲線具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。所用引物均由三博公司合成，所用TaqMan探針由上海生工合成，所有序列測定工作均由華大公司完成。實施例l、用于對藍舌病毒(BTV)進行定性、定量檢測的引物及TaqMan探針的設計根據GenBank中8個血清型BTV的NSl基因序列，利用DNAStar軟件對該8個血清型BTV的NS1基因進行序列比對，選取NS1基因5'端的最保守區域序列作為檢測序列。由于該8個血清型BTVNSl基因中有6個血清型BTVNSl基因序列(GenBankAccessionNo.AY462225、M97762、NC—006025、X15891、X56735、Y00422)包括較長的5，非編碼區序列，利用DNAStar軟件對該6個血清型/株BTVNSl基因序列進行比對，然后根據比對結果設計引物及TaqMan探針，序列如下上游引物P(NS1-1):5，-GTTCTCTAGTTGGCAACCACC-3，(序列表中SEQIDNO:1)，Tm為57°C;下游引物P(NS1-2):5，-GTGACTGCAAGTCCATTGAGG-3，(序列表中SEQIDNO:2)，Tm為57°C。TaqManProbel(NSl):5，FAM-AGTTCTCGTGGCATTTGCGTAATCC-TAMRA3，(序列表中SEQIDNO:3)，Tm為67°C。TaqManProbe2(NSl):5，FAM-ATTACGCAAATGCCACGAGAACT-TAMRA3，(序列表中SEQIDNO:4)，Tm為62°C。將上游引物命名為P(NS1-1)，序列表中的SEQIDNa:1由21個堿基組成，該序列位于BTVNS1基因(又稱S6基因)自5'端第10-30堿基；將下游引物命名為P(NS1-2)，SEQIDNa:2由21個堿基組成，該序列為BTVNSl基因自5'端第110-130堿基的反向互補序列。所述NS1基因指含有5'端非編碼區核苷酸序列的全基因。將具有序列表中SEQIDNO:3的TaqMan探針命名為TaqManProbel(NS1)，序列表中的SEQIDN2:3由25個堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5'端第70-94位堿基的反向互補序列。將具有序列表中SEQIDNO:4的TaqMan探針命名為TaqManProbe2(NS1)，序列表中的SEQIDN2:4由23個堿基組成，該序列為BTVNS1基因自5，端第72-94位堿基。將上述TaqMan探針的5，端標記報告熒光基團FAM，3，端標記淬滅熒光基團TAMRA，并將探針的3'端進行磷酸化處理。實施例2、用本發明的引物對藍舌病毒進行BTV的常規PCR檢測1、BTV樣品的處理選用經細胞培養的BTV、血漿及組織中的8個血清型(分別為BTV3、BTV5、BTV8、BTVIO、BTVll、BTV21、BTV22、BTV(A)型)的BTV作為待測BTV樣品。用下述方法對經細胞培養的BTV樣品進行處理先接種BTV至BHK-21細胞，在37'C的C02溫箱中培養至細胞病變達80%以上，然后在無菌條件下將病變細胞移入滅菌離心管中，8000rpm離心30min，在無菌條件下將上清移入另一離心管中暫置于室溫下，將細胞沉淀反復凍融三次后加入上清，吹打混勻，8000rpm離心30min，取上清用于BTVRNA的提取。血漿及組織中的BTV樣品無需進行處理。2、BTVRNA的提取上述BTV樣品各取300u1，用Body-fluidviralDNA/ViralRNAMini-pr印試劑盒(V-Gene)并參照試劑盒說明書提取RNA。3、反轉錄分別以步驟2提取的不同BTV樣品的RNA為模板，反轉錄合成其cDNA，反應體系及反應條件為取BTVRNA9ul，加下游特異性引物P(NS1-2)2ul(50pg/ul)，混勻，97。C水浴5min，迅速置于冰水上5min，再在冰盒上加入M-MLV緩沖液4u1、dNTPs(2.5mMeach)4u1(TaKaRa)、M-MLVRT1u1(TaKaRa)、RNasin0.5u1(TaKaRa)，混勻，42。C反應lh。4、常規PCR檢測分別以步驟3反轉錄合成的不同BTV樣品的cDNA為模板，在本發明引物P(NS1-1)和P(NS1-2)的引導下進行PCR擴增，25ulPCR反應體系為IOXPCR緩沖液2.5ul，d證s(2.5mMeach)2ul，P(NSl-l)O.5u1(50pg)，P(NS1—2)0.5u1(50pg)，cDNA5ul，Taq酶lul(TaKaRa)，ddH2013.5ul。PCR反應條件為:先94°C5min;然后94°C45s，45°C45s，72°Clmin，共35個循環；最后72°C7min，4。C終止反應。反應結束后，取PCR擴增產物各6u1進行2.5X瓊脂糖凝膠電泳檢測(70V電泳30rain)，檢測結果如圖1所示(泳道M:MarkerDL2000，泳道A:BTV3，泳道B:BTV5，泳道C:BTV8，泳道D:BTVIO，泳道E:BTVll，泳道F:BTV21，泳道G:BTV22，泳道H:BTV(A))，結果經細胞培養的8個血清型的BTV樣品(BTV-3、5、8、10、11、21、22、(A))經PCR擴增均得到了121bp的目的條帶，與預期結果相符，表明本發明的引物可用于藍舌病毒的常規PCR檢測。實施例3、用本發明的引物及TaqMan探針進行BTV的實時熒光定量PCR(real-1iraeFQPCR)檢測1、BTV的培養及處理選用經細胞培養的BTV作為待測BTV樣品，并用與實施例2中相同的方法對經細胞培養的BTV樣品進行處理。2、BTVRNA的提取取步驟1獲得的BTV樣品300u1，用與實施例2中相同的方法提取RNA。3、反轉錄以步驟2提取的BTV樣品的RNA為模板，反轉錄合成其cDNA，反應體系及反應條件與實施例2中相同。4、real-timeFQPCR標準品的制備(1)BTV-5的PCR擴增產物回收取實施例2獲得的檢測樣品BTV5的PCR擴增產物50u1，對其進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳(70V電泳30min)，在紫外燈下切取121bp的目的條帶，然后用WizardSVGelandPCRClean-upSystem(Promega)并參照試劑盒說明書對該目的片斷進行回收及純化。(2)連接將步驟(1)回收的121bp的目的片斷與pGEM-TEasyVector進行連接，連接體系及條件為回收產物8iU，2XT4DNA連接酶緩沖液10ul，pGEM-TEasyVector1u1(Proraega)，T4DNA連接酶1u1(Promega)，混勻，16。C反應2h后，4。C放置12-24h。(3)轉化取步驟(2)的連接產物20u1，加入100u1用CaCl2法制備的DH5a感受態細胞，輕輕旋轉混勻，冰水上放置30min,然后42"C熱激2min，再迅速置冰水上5min，加入800u1LB液體培養基，37。C搖床培養lh，6000rpm離心5min，棄約800y1上清，用剩余上清吹打懸浮沉淀，并將菌懸液涂布于LB抗性選擇平板(含氨芐青霉素(A即)50mg/L，50mg/mLX-gal16ul，200mg/mLIPTG4ul)上，在37。C下培養12-24h。(4)菌落PCR檢測隨機挑取在LB抗性選擇平板上長出的3個白斑進行菌落PCR擴增，PCR反應體系及反應條件與實施例2中的常規PCR所用的相同。反應結束后，取PCR擴增產物6u1，對其進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(70V電泳30rain)，檢測結果如圖2所示(泳道M:MarkerDL2000,泳道A:菌落l,泳道B:菌落2，泳道C:菌落3)，結果其中1個克隆(菌落l)經PCR擴增出現了121bp的目的條帶。(5)提取陽性克隆的質粒挑取步驟(4)經初步鑒定的陽性單克隆，將其接種于含50mg/LAmp的LB液體培養基中，在37"C、300rpm下搖床培養14h，然后用高純度質粒提取試劑盒(法特捷)提取質粒，將該質粒命名為pGEM-T120。取提取的質粒pGEM-T1205y1，對其進行2.5^瓊脂糖凝膠電泳檢測(70V電泳30min)，檢測結果如圖3所示(泳道M:MarkerDL2000，泳道A和泳道B:pGEM-T120)，質粒pGEM-T120的條帶大小約為3kb，與預期結果相符。(6)測序將攜帶有pGEM-T120的重組菌命名為DH5a(pGEM-T120)，取DH5a(pGEM-T120)菌液進行測序，結果pGEM-T120所攜帶擴增片斷具有序列表中SEQIDN2:5的核苷酸序列，表明pGEM-T120所攜帶的121bp的擴增片斷與BTVNS1基因中的待擴增序列(BTVNS1基因自5'端第10-130位堿基)完全一致，構建的質粒序列正確。(7)pGEM-T120的濃度測定取pGEM-T120原液20ul，稀釋至100u1ddH20中，用紫外分光光度計測定0D26。值，結果測得pGEM-T120原液的濃度為31.7yg/mL，1u1pGEM-T120原液含9X109個拷貝。5、用TaqManProbel(NSl)對BTV樣品進行real-timeFQPCR檢測(l)繪制標準曲線將pGEM-T120原液按IOX系列稀釋為104、105、106、107個拷貝進行real-timeFQPCR檢測，25u1反應體系為10XPCR緩沖液2.5u1，dNTPs(2.5mMeach)2yl，P(NSl-1)1ti1(50pg)，P(NS1-2)1y1(50pg)，TaqManProbel(NS1)0.5y1(25pg)，pGEM-T1201u1，Taq酶1n1(TaKaRa)，MgCl"25mM)2.5iU(P簡ega)，ddH2013.5u1。反應條件為先94。C3min;然后94°C30s，45°C45s，72°C20s，共40個循環。結果各稀釋度的pGEM-T120均能產生熒光信號，Ct值分別為29.63、24.83、21.06、18,08，擴增曲線見圖4A，定量數據見表l，由擴增曲線得到的標準曲線斜率為-3.933，標準曲線見圖5(Y=-3.933X+45.257)。表l不同稀釋度pGEM-T120以及BTV-5、8、10、21、22、(A)樣品熒光定量PCR的定量數據<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)BTV樣品的real-tiraeFQPCR檢測首先對6個BTV血清型的待測樣品(BTV5、BTV8、BTVIO、BTV21、BTV22、BTV(A))進行real-timeFQPCR檢測，除模板(由RNA反轉錄形成的cDNA)夕卜，反應體系及反應條件與步驟(1)相同，擴增曲線見圖4B，定量數據見表l，在標準曲線上的位點見圖6，其Ct值依次為22.50、35.92、32.98、26.24、28.18、28.07，擴增起始濃度拷貝數依次為5.58X105、1.73X102、1.03X103、6.03X104、2.OOXIO4、2.12X104。然后對另外2個BTV血清型樣品(BTV3、BTV11)用相同方法進行rea1-timeFQPCR檢測，擴增曲線見圖6，其Ct值依次為22.20、19.37，擴增起始拷貝數依次為7.21X105、3.85X106。此外，用TaqManProbe2(NS1)對上述BTV樣品進行real-timeFQPCR檢測，結論相同，表明本發明的TaqManProbel(NSl)和TaqManProbe2(NS1)均可用于BTV的real-timeFQPCR檢測。序列表<160〉5〈210〉1〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223>〈400>1gttctctagttggcaaccacc<210〉2〈211〉21<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223><400>2gtgactgcaagtccattgagg〈210〉3〈211〉25<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223><400>3agttctcgtggcatttgcgtaatcc〈210〉4<211〉23<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉4attacgc33atgccacgagaact23<210〉5<211>121〈212〉DNA<213〉藍舌病毒(bluetonguevirus,BTV)〈400〉gttctctagttggcaaccaccaaacatggagcgctttttgagaaaatacaacatcagtggggattacgcaaatgccacgagaacttttttggctatttcacctcaatggacttgcagtca權利要求1.用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物，其上游引物由序列表中的SEQID№1表示，下游引物由序列表中的SEQID№2表示。2、權利要求l所述引物的衍生序列。3、根據權利要求2所述的衍生序列，其特征在于所述衍生序列是在SEQIDN2:1和/或SEQIDNa:2的基礎上經過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。4、檢測藍舌病毒的實時熒光定量PCR試劑盒，包括權利要求1所述的用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物。全文摘要本發明公開了用于對藍舌病毒進行定性、定量檢測的引物。該引物的上游引物具有序列表中的SEQID№1，下游引物具有序列表中的SEQID№2。本發明所提供的引物可用于臨床及科研中對感染藍舌病的動物中的藍舌病毒RNA進行定性及定量分析，對判斷藍舌病的發生、復發，治療效果評價及病情的動態觀察具有重要意義。本發明將在動物醫學檢測領域發揮重要作用。文檔編號C12Q1/70GK101280343SQ200810094049公開日2008年10月8日申請日期2006年5月16日優先權日2006年5月16日發明者尹惠瓊,章金剛申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所